研究背景骨质疏松症在绝经后妇女和老年人群中有较高的患病率,易引发骨折,是老年患者致残和致死的主要原因之一。骨质疏松已成为全世界重要的公共卫生问题。骨组织的稳态维持是一个分别由成骨细胞和破骨细胞导致的骨形成和骨吸收的动态调控过程。骨质疏松最直接的原因是骨组织中成骨细胞功能降低,而破骨细胞功能增强,这种骨形成和骨吸收的动态平衡被打破,导致骨量减少,骨脆性增加。目前临床上治疗骨质疏松药物的主要机制是抑制骨吸收和促进骨形成,在应用过程中出现各种副作用,新机制的研究将为新药物的开发提供理论依据。近年来的研究表明,线粒体在骨代谢平衡过程中发挥重要的作用。MCU（Mitochondrial Calcium Uniporter,线粒体钙离子单向转运体）作为线粒体唯一的钙离子单向转运通道蛋白,对线粒体功能的维持具有重要作用。本研究聚焦在MCU与骨质疏松的相关性,以及MCU对骨组织细胞的调控作用及机制研究,在此基础上进一步探究以MCU为靶点对抗骨质疏松的潜在作用。研究目的1.明确MCU与骨质疏松的相关性;2.明确MCU对破骨细胞及成骨细胞功能的影响;3.阐明MCU对破骨细胞或成骨细胞功能调控的作用机制;4.探讨以MCU为靶点对抗骨质疏松的作用。研究方法与内容1.利用合作单位苏州大学第二附属医院提供的临床骨折患者松质骨样本、小鼠OVX（Ovariectomy,卵巢摘除术）及小鼠尾部悬吊后肢去负荷诱发的骨丢失模型,通过Western Blot、Q-PCR分析骨质疏松样本中MCU表达变化,明确MCU与骨质疏松的相关性;2.利用细胞诱导分化,分析在破骨细胞和成骨细胞分化过程中MCU表达变化;利用细胞转染si RNA技术,分析敲低MCU,成骨细胞和破骨细胞分化和功能的变化,阐明MCU对成骨细胞及破骨细胞分化和功能的影响;3.通过构建单核细胞和破骨细胞特异性Mcu基因敲除小鼠,分析其骨表型变化及破骨细胞分化和功能变化,在体内明确MCU对破骨细胞分化和功能的影响;4.利用线粒体特异的钙荧光载体,分析破骨细胞分化过程中MCU介导的线粒体钙变化;利用活性氧荧光探针及ATP检测试剂盒,分析破骨细胞分化过程中线粒体功能的变化,揭示MCU调控破骨细胞分化和功能的机制;5.利用破骨细胞特异性Mcu基因敲除小鼠,通过构建小鼠卵巢摘除术及小鼠尾部悬吊后肢去负荷诱发的骨丢失模型,μCT分析建模后骨表型变化,探究破骨细胞特异性Mcu基因敲除小鼠对抗骨丢失的作用。研究结果1.通过对临床骨样本、小鼠去卵巢术骨丢失样本、小鼠后肢悬吊模拟去负荷骨丢失样本检测分析,得出MCU与骨丢失正相关。2.体外细胞实验证实MCU促进破骨细胞的分化和功能,MCU对成骨细胞的分化和功能未见明显的作用。3.单核细胞和破骨细胞特异性Mcu基因敲除小鼠骨量增加。相比对照,单核细胞特异性Mcu基因敲除小鼠BMD（Bone Mineral Density,骨矿物密度）升高48.95%、BV/TV（Bone Volume/Tissue Volume,骨体积比组织体积）升高46.17%。相比对照,破骨细胞特异性Mcu基因敲除小鼠BV/TV升高32.74%。单核细胞和破骨细胞特异性Mcu基因敲除小鼠破骨细胞功能降低。相比对照,单核细胞特异性Mcu基因敲除小鼠骨小梁破骨细胞面积减少,血清CTX-1（Ctelopeptide of Type Ⅰ Collagen,Ⅰ型胶原C端肽）蛋白水平降低42.76%,破骨细胞分化和功能基因表达下降。相比对照,破骨细胞特异性Mcu基因敲除小鼠破骨细胞面积减少,破骨细胞分化和功能基因表达下降。4.在破骨细胞分化过程中线粒体钙信号明显增强,ATP水平在诱导前期显著增加,随后迅速下降,而ROS含量在破骨细胞分化中后期明显增加。破骨细胞分化过程中线粒体面积和直径增加,线粒体数目增加。MCU敲除后,破骨细胞诱导分化前期ATP水平降低,丙酮酸脱氢酶活性降低,磷酸化AMPK水平明显升高,而在破骨细胞分化中后期,线粒体活性氧降低,受活性氧调控的RANKL/RANK下游信号分子活性降低。5.破骨细胞特异性Mcu基因敲除小鼠对卵巢摘除术及尾部悬吊后肢去负荷诱发的骨丢失具有对抗作用。结论1.MCU与骨质疏松成正向相关。2.MCU促进破骨细胞的分化和功能,单核细胞和破骨细胞特异性Mcu基因敲除小鼠破骨细胞功能降低,骨量增加。3.MCU在破骨细胞分化不同阶段发挥不同作用,在破骨向诱导分化前期MCU介导的线粒体钙含量增加有助于线粒体ATP生成,影响能量代谢,MCU介导的线粒体钙含量增加在破骨向诱导分化后期有助于线粒体产生活性氧,从而有助于破骨细胞分化和功能。4.可通过干预破骨细胞MCU进而干预骨丢失,为治疗骨质疏松提供了可利用的新的潜在的药物靶点。