番木瓜(Carica papaya L.)是一种广受人们喜爱的水果和重要的热带经济作物,但番木瓜果树自身抗病毒力较弱,很容易受到病毒的侵害,其中番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)是一种新的威胁番木瓜种植业的病毒病害,近年来发病率逐年递增,已成为继木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)为害最严重的病毒病害。目前,PLDMV在栽培技术上如PRSV一样也很难通过化学防治的方法予以防控。所以,急需寻找到一种更为安全且广谱的抗病毒新策略。而这种抗病毒新策略的获得需要在PLDMV致病机理、PLDMV弱毒株“植物疫苗”及基因功能鉴定等方面取得一定的工作积累。本研究就是基于这些关键技术环节开展了系列的研究,以期为开辟安全广谱的抗PLDMV新策略奠定良好的理论和技术基础。开展上述这些研究工作,都会涉及植物病毒表达载体构建的关键环节,这是研究植物病毒的基础,也是最为关键的内容之一。由于许多植物病毒基因组较大,且会在大肠杆菌体内产生毒性,所以带有病毒全长表达载体的构建一直是研究工作的难点。本研究通过将病毒全长分段扩增,然后利用在体外进行Gibson拼接后直接转化农杆菌的方法,能快速、高效、稳定的构建病毒侵染性克隆,相对于传统的体外转录或者酵母同源重组的方法成功率更高、时间更节省而且成本相对较低,本研究获得的植物病毒表达载体构建方法有利于有效开展后续的科研工作。因此,本研究利用这种新方法构建了多种PLDMV病毒表达载体,并开展了如下科研工作:一.构建含有荧光标签的PLDMV表达载体并初步探索了番木瓜的基因沉默系统。本研究对感染了PLDMV-GFP的番木瓜植株进行病毒来源的Small RNA高通量测序分析。综合Vsi RNAs丰度、分布热点、类别、长度和碱基偏好性等特性方面的差异,分析所获得的数据和结果,从RNA沉默的角度初步探究番木瓜RNA沉默系统及病毒侵染机制,预测了Vsi RNAs靶基因序列,并对沉默系统中的关键基因进行了验证,所获得的结果为深入研究病毒的致病机理和制定抗病毒新策略的奠定了理论基础,同时为抗病毒病害育种技术的发展提供参考和指导。二.利用点突变技术构建突变体弱毒株并验证了其交叉保护效果及原理。使用弱毒株“植物疫苗”对番木瓜植株进行交叉保护是一种较为高效广谱的绿色病毒防控技术。本研究基于交叉保护的原理,利用点突变技术对PLDMV的致病关键区域HC-Pro中的两个保守区域KITC和FRNK进行了突变,构建了三种突变体弱毒株PLDMV-E、PLDMV-I、PLDMV-EI,并通过攻毒实验对所构建的弱毒株进行了验证,其中双位点突变弱毒株PLDMV-EI能在进行交叉保护的60天内未产生明显症状且对强毒株系保护效果明显,有望成为一种温和有效且对环境友好的交叉保护突变体弱毒株疫苗。通过大田试验进一步验证其在自然界中对PLDMV病毒的保护效果,经统计分析PLDMV-EI突变体弱毒株的相对防控效率达到70.94%。PLDMV突变体弱毒株的构建为获得番木瓜病毒防控新方法和新策略奠定了良好的基础。三.建立了番木瓜VIGS基因功能鉴定平台并测定其CYP83B1基因功能。一种对寄主温和不产生明显症状的弱毒株是构建VIGS(Virus Induced Gene Silencing,病毒诱导的基因沉默)基因功能鉴定载体的良好材料。本研究利用PLDMV-E突变体弱毒株构建了PLDMV-VIGS载体,很大程度上避免了植物病症对沉默表型的干扰。通过对NIb蛋白与CP蛋白之间插入指示基因PDS和Chl H的PLDMV-VIGS载体进行实验,验证了不同插入片段长度与环境温度对VIGS载体沉默效率的影响,建立了PLDMV-VIGS番木瓜基因功能鉴定平台。并以此平台测定番木瓜CYP83B1基因功能,利用表征判断、q RT-PCR以及高效液相色谱等方法,成功分析番木瓜CYP83B1基因是苄基葡萄糖硫苷生成途径中的关键基因。PLDMV-VIGS作为一种拥有操作程序简单、运行成本低、分析周期短、同时不需要遗传转化等优势的基因功能鉴定手段,为开展番木瓜功能基因组学研究提供了重要的技术支持,同时更为我国生物学领域占领功能基因组学的制高点提供了一个颇具战略意义的工具。已完成的番木瓜基因组的分析表明,番木瓜基因组是已发现的基因数目最小的显花植物基因组(372 Mb),且拥有良好的基因转化系统(为全球第一种商业化转基因果树)和较短的生长周期,所以番木瓜具有作为“模式植物”的重大潜力。因此,对番木瓜基因沉默体系的解析具有重要的科学意义。而PLDMV还可侵染葫芦科作物,所以PLDMV弱毒株的构建和PLDMV-VIGS载体沉默平台的建立也为其他葫芦科经济作物的研究打下了坚实的基础。可见,本课题从植物病毒与植物寄主间相关性方面开展了系列研究,这对推动果树学的抗病育种研究具有重要科学意义。