不同毛色山羊皮肤组织ASIP蛋白表达与Agouti基因剪接体类型研究

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利用蛋白免疫印迹技术(Western blotting)对3只白色山羊、3只黑色山羊和3只棕色山羊皮肤组织Agouti基因所编码ASIP蛋白表达量的差异进行研究,结果显示ASIP在不同毛色山羊皮肤组织中表达量为:白色山羊(0.94±0.19)>棕色山羊(0.74±0.08)>黑色山羊(0.57±0.18)。ASIP表达量在白色和黑色(P=0.03)山羊皮肤组织之间差异显著,在白色和棕色(P=0.17)、棕色和黑色(P=0.21)山羊皮肤组织之间差异不显著。已获得的12847bp山羊Agouti基因序列与绵羊CH243-455O4反向互补序列进行比对,二者相似性为97%。以绵羊CH243-455O4反向互补序列为模板设计引物进行PCR扩增:利用7对引物扩增CH243-455O4反向互补序列中102364-118525bp的位置,白色、黑色山羊扩增获得的序列长度分别为16161bp、16226bp,所得序列与12847bp的序列进行拼接,分别得到长度为27793bp、27858bp的白色、黑色山羊Agouti基因的基因组序列;利用3对引物分别扩增CH243-455O4反向互补序列中包括53571-53651、57572-57650、64870-64928这3段的序列,白色、黑色山羊获得的包含此三段序列的长度分别为:364bp、2625bp、1296bp;367bp、2622bp、1298bp。Spidey软件将绵羊mRNA(NM001134303.1)与扩增获得的4段Agouti基因的基因组序列进行外显子、内含子预测,结果显示:目前获得的山羊Agouti基因5′非翻译区序列有4段与绵羊mRNA序列相匹配,长度分别为:88bp、180bp、81bp、79bp。推测山羊Agouti基因5′非翻译区可能由4个或更多不同长度不编码蛋白质的外显子组成。选用4只白色、3只黑色山羊皮肤组织,通过5′RACE实验对山羊mRNA进行测序研究,得到:白色山羊(B2)Agouti基因5′非翻译区外显子1存在5种可变剪接形式,分别为It、It′、IA、2C、IE;黑色山羊(H1、H2)Agouti基因5′非翻译区外显子1存在2种可变剪接形式,分别为It、It′;不同类型剪接体的序列长度不同,白色、黑色山羊中It、It′均存在不同程度的缺失;根据不同毛色山羊所具有的不同剪接体类型推断:IA、2C、IE可变剪接体可能是山羊白色形成的原因。白色山羊(B1)69-109bp这段序列在Agouti基因外显子4上也检测到,设计相应引物进行PCR扩增,验证得出白色山羊(B1)存在40bp重复。根据白色、黑色山羊It、It′以及白色山羊IA在基因组序列上所处的位置推测:5′RACE所检测的4只白色山羊和3只黑色山羊均存在拷贝,但此结果有待进一步的研究。
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