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背景：重度抑郁症(Major depressive disorder, MDD)，已成为全球性疾病，其发病率逐年上升，是一种涉及个体遗传、生存环境共同作用所导致的慢性多因素性神经精神类疾病[1]。社交和人际关系相关的社会生活压力，是导致抑郁症重要的危险因素。目前研究表明，抑郁症最常见的发病时间集中在了一个人的20多岁到30多岁之间[2]。因此，抑郁症正在成为影响年轻人身心健康的严重问题。基础和临床研究表明，抑郁症与调节情绪和认知的大脑区域缩小有关，包括前额叶皮质和海马体，伴有神经元突触减少[3]。内侧前额叶皮质(mPFC)是参与调节病理性应激反应的关键脑区之一[4]，包括情感障碍，神经内分泌反应以及认知功能的改变[5]。
神经调节蛋白1(Neuregulin 1, NRG1)是神经胶质细胞及神经元产生的细胞间信号转导蛋白，广泛分布于额叶皮质，中脑和小脑，属于表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)蛋白家族成员，该蛋白通过与受体酪氨酸激酶的ErbB家族相互作用[6]，对神经系统的正常发育，突触可塑性，神经元迁移等发挥重要作用[7]。研究表明，皮质投射神经元内NRG1的缺失导致抑制性连接的增加和突触可塑性的降低，而慢性应激可能导致前额叶皮质树突复杂性和树突棘密度降低[8]。社会压力对抑郁样行为的影响已通过小鼠的慢性社会挫败应激(Chronic social defeat stress, CSDS)范式进行了广泛的研究[9]。但是，目前尚不清楚慢性压力如何影响由内侧前额叶皮质(mPFC)的损伤导致的神经行为改变，以及mPFC中的NRG1是否涉及应激易感性。有研究证明，泛素化可以通过将表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)家族靶向蛋白酶体或溶酶体来调节是EGFR家族的受体水平[10,11]。神经前体细胞表达的发育下调基因4-2(Nedd4-2，又称Nedd4l)，属于E3泛素连接酶的Nedd4家族[12]。Nedd4l的研究较少，尤其是在抑郁相关或是应激研究领域，Nedd4l与NRG1的关系还没有相关报道。因此，了解压力诱导的行为反应和潜在的行为脆弱性的分子机制，可以对阐明抑郁症的发生和发展机制进行更深入的研究。
目的：通过建立小鼠的慢性社会挫败应激模型，检测与抑郁行为相关脑区中NRG1的蛋白以及基因表达的变化，明确Nedd4l对NRG1可能存在的调控关系是否参与应激诱导抑郁样行为的作用机制，为抑郁症的发病机制提供新线索。
方法：使用CSDS范式构建小鼠抑郁模型，通过蛋白免疫印迹(Western blotting)检测目的蛋白表达水平的改变，实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR, Q-PCR)定量分析目的基因mRNA的表达差异。并在原代皮质神经元培养实验中，通过使用糖皮质激素受体激动剂地塞米松(Dex)，介导细胞水平的慢性应激，检测其对基因表达的影响。通过免疫共沉淀实验(Co-IP)和脑片免疫荧光确定Nedd4l与NRG1的相互作用与共定位情况。在小鼠的mPFC脑区中，分别显微注射过表达NRG1，过表达和敲降Nedd4l的腺相关病毒，检测应激介导的小鼠焦虑抑郁相关行为学。通过高尔基染色观察mPFC脑区的树突棘变化。
结果：通过分析CSDS范式中的社交比率(SI ratio)，我们发现有60%的实验组小鼠表现出了应激敏感性行为，定义为应激敏感型小鼠(Stress-susceptible, SS)，其余对应激不易感的小鼠，称为抵抗型小鼠(Resilient, RES)。一系列行为学检测显示：SS小鼠和RES小鼠与对照组小鼠(Control, CTR)相比表现出明显的焦虑抑郁样性行为。高尔基染色结果显示SS小鼠mPFC脑区的树突棘减少。对小鼠脑组织样本进行蛋白免疫印迹实验，我们发现SS小鼠的mPFC中NRG1的蛋白表达水平降低。然而，Q-PCR结果显示SS小鼠mPFC中NRG1mRNA水平并没有发生改变。同样的，在细胞水平，用Dex处理原代皮质神经元导致细胞应激，也可导致NRG1蛋白水平降低，但其mRNA水平不变。在Dex处理后的细胞中，使用蛋白质生物合成抑制剂放线菌酮(CHX)作用4h、8h或12h后，与对照组相比，Dex处理明显促进NRG1的降解。同时，在Dex处理的细胞中，使用蛋白酶体抑制剂MG132可阻止Dex引起的NRG1的减少，但并不影响NRG1mRNA水平，以上结果提示：慢性应激时NRG1降解增强，蛋白水平降低。使用病毒在mPFC脑区过表达NRG1，发现：与经历了CSDS的对照小鼠相比，在mPFC区上调NRG1减轻CSDS诱导的抑郁样行为。对小鼠mPFC脑组织的mRNA转录组测序结果可见SS小鼠和对照小鼠相比上调的基因有670个，下调的基因有462个，分析与NRG1的蛋白质降解增加相关的信号通路，可见E3泛素连接酶Nedd4l的mRNA水平升高，检测mPFC区蛋白水平也发现Nedd4l蛋白水平上调。
在SS小鼠的mPFC脑区中，Nedd4l和NRG1之间具有明显的蛋白质相互作用关系，而且SS小鼠中NRG1的泛素化明显增加。免疫荧光显示Nedd4l和NRG1在SS小鼠的mPFC脑区的细胞质中存在共定位。用Dex处理培养成熟的原代皮质神经元模拟细胞水平的慢性应激可下调NRG1表达，同时Nedd4l的表达上调，NRG1的泛素化水平增加。在Dex处理的原代皮质神经元中同时给予LV-SiNedd4l病毒下调Nedd4l可以恢复NRG1表达，提示Nedd41与NRG1的降解密切相关。在动物实验中，使用阈下社会挫败应激(Subthreshold social defeat stress，SSDS)的范式可增加动物对应激的敏感性，而不会导致社会回避的抑郁样行为。给予过表达Nedd4l的病毒后，在没有经历SSDS的小鼠中，Nedd4l的过表达不改变其行为表型，而过表达Nedd4l可以明显增加SSDS小鼠的抑郁样行为，并导致小鼠mPFC中NRG1的泛素化显著增加、NRG1蛋白水平显著降低，并且伴有树突棘的损伤。给予敲降Nedd4l的病毒后，我们发现在无应激的小鼠中，Nedd4l基因的敲低不改变行为表型。下调Nedd4l可以减轻CSDS诱导的抑郁样行为。相较于经历CSDS的对照小鼠，Sh-Nedd4l小鼠的mPFC中NRG1泛素化水平显著下降、NRG1蛋白显著增加。高尔基染色显示下调Nedd4l逆转CSDS引起的树突棘减少。
结论：CSDS诱导抑郁样行为伴内侧前额叶皮质脑区中NRG1降解增加，NRG1蛋白水平降低。过表达NRG1减轻CSDS诱导的抑郁样行为，提示NRG1参与CSDS诱导抑郁样行为。应激易感小鼠内侧前额叶皮质脑区E3泛素连接酶Nedd4l上调促进NRG1泛素化增加，导致NRG1蛋白水平降低，引起突触树突棘损伤，诱发应激所致小鼠抑郁样行为。下调Nedd4l阻止NRG1的降解进程，恢复NRG1水平，缓解CSDS所致抑郁样行为。本研究结果为抑郁症的发病机制提供新线索。
神经调节蛋白1(Neuregulin 1, NRG1)是神经胶质细胞及神经元产生的细胞间信号转导蛋白，广泛分布于额叶皮质，中脑和小脑，属于表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)蛋白家族成员，该蛋白通过与受体酪氨酸激酶的ErbB家族相互作用[6]，对神经系统的正常发育，突触可塑性，神经元迁移等发挥重要作用[7]。研究表明，皮质投射神经元内NRG1的缺失导致抑制性连接的增加和突触可塑性的降低，而慢性应激可能导致前额叶皮质树突复杂性和树突棘密度降低[8]。社会压力对抑郁样行为的影响已通过小鼠的慢性社会挫败应激(Chronic social defeat stress, CSDS)范式进行了广泛的研究[9]。但是，目前尚不清楚慢性压力如何影响由内侧前额叶皮质(mPFC)的损伤导致的神经行为改变，以及mPFC中的NRG1是否涉及应激易感性。有研究证明，泛素化可以通过将表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)家族靶向蛋白酶体或溶酶体来调节是EGFR家族的受体水平[10,11]。神经前体细胞表达的发育下调基因4-2(Nedd4-2，又称Nedd4l)，属于E3泛素连接酶的Nedd4家族[12]。Nedd4l的研究较少，尤其是在抑郁相关或是应激研究领域，Nedd4l与NRG1的关系还没有相关报道。因此，了解压力诱导的行为反应和潜在的行为脆弱性的分子机制，可以对阐明抑郁症的发生和发展机制进行更深入的研究。
目的：通过建立小鼠的慢性社会挫败应激模型，检测与抑郁行为相关脑区中NRG1的蛋白以及基因表达的变化，明确Nedd4l对NRG1可能存在的调控关系是否参与应激诱导抑郁样行为的作用机制，为抑郁症的发病机制提供新线索。
方法：使用CSDS范式构建小鼠抑郁模型，通过蛋白免疫印迹(Western blotting)检测目的蛋白表达水平的改变，实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR, Q-PCR)定量分析目的基因mRNA的表达差异。并在原代皮质神经元培养实验中，通过使用糖皮质激素受体激动剂地塞米松(Dex)，介导细胞水平的慢性应激，检测其对基因表达的影响。通过免疫共沉淀实验(Co-IP)和脑片免疫荧光确定Nedd4l与NRG1的相互作用与共定位情况。在小鼠的mPFC脑区中，分别显微注射过表达NRG1，过表达和敲降Nedd4l的腺相关病毒，检测应激介导的小鼠焦虑抑郁相关行为学。通过高尔基染色观察mPFC脑区的树突棘变化。
结果：通过分析CSDS范式中的社交比率(SI ratio)，我们发现有60%的实验组小鼠表现出了应激敏感性行为，定义为应激敏感型小鼠(Stress-susceptible, SS)，其余对应激不易感的小鼠，称为抵抗型小鼠(Resilient, RES)。一系列行为学检测显示：SS小鼠和RES小鼠与对照组小鼠(Control, CTR)相比表现出明显的焦虑抑郁样性行为。高尔基染色结果显示SS小鼠mPFC脑区的树突棘减少。对小鼠脑组织样本进行蛋白免疫印迹实验，我们发现SS小鼠的mPFC中NRG1的蛋白表达水平降低。然而，Q-PCR结果显示SS小鼠mPFC中NRG1mRNA水平并没有发生改变。同样的，在细胞水平，用Dex处理原代皮质神经元导致细胞应激，也可导致NRG1蛋白水平降低，但其mRNA水平不变。在Dex处理后的细胞中，使用蛋白质生物合成抑制剂放线菌酮(CHX)作用4h、8h或12h后，与对照组相比，Dex处理明显促进NRG1的降解。同时，在Dex处理的细胞中，使用蛋白酶体抑制剂MG132可阻止Dex引起的NRG1的减少，但并不影响NRG1mRNA水平，以上结果提示：慢性应激时NRG1降解增强，蛋白水平降低。使用病毒在mPFC脑区过表达NRG1，发现：与经历了CSDS的对照小鼠相比，在mPFC区上调NRG1减轻CSDS诱导的抑郁样行为。对小鼠mPFC脑组织的mRNA转录组测序结果可见SS小鼠和对照小鼠相比上调的基因有670个，下调的基因有462个，分析与NRG1的蛋白质降解增加相关的信号通路，可见E3泛素连接酶Nedd4l的mRNA水平升高，检测mPFC区蛋白水平也发现Nedd4l蛋白水平上调。
在SS小鼠的mPFC脑区中，Nedd4l和NRG1之间具有明显的蛋白质相互作用关系，而且SS小鼠中NRG1的泛素化明显增加。免疫荧光显示Nedd4l和NRG1在SS小鼠的mPFC脑区的细胞质中存在共定位。用Dex处理培养成熟的原代皮质神经元模拟细胞水平的慢性应激可下调NRG1表达，同时Nedd4l的表达上调，NRG1的泛素化水平增加。在Dex处理的原代皮质神经元中同时给予LV-SiNedd4l病毒下调Nedd4l可以恢复NRG1表达，提示Nedd41与NRG1的降解密切相关。在动物实验中，使用阈下社会挫败应激(Subthreshold social defeat stress，SSDS)的范式可增加动物对应激的敏感性，而不会导致社会回避的抑郁样行为。给予过表达Nedd4l的病毒后，在没有经历SSDS的小鼠中，Nedd4l的过表达不改变其行为表型，而过表达Nedd4l可以明显增加SSDS小鼠的抑郁样行为，并导致小鼠mPFC中NRG1的泛素化显著增加、NRG1蛋白水平显著降低，并且伴有树突棘的损伤。给予敲降Nedd4l的病毒后，我们发现在无应激的小鼠中，Nedd4l基因的敲低不改变行为表型。下调Nedd4l可以减轻CSDS诱导的抑郁样行为。相较于经历CSDS的对照小鼠，Sh-Nedd4l小鼠的mPFC中NRG1泛素化水平显著下降、NRG1蛋白显著增加。高尔基染色显示下调Nedd4l逆转CSDS引起的树突棘减少。
结论：CSDS诱导抑郁样行为伴内侧前额叶皮质脑区中NRG1降解增加，NRG1蛋白水平降低。过表达NRG1减轻CSDS诱导的抑郁样行为，提示NRG1参与CSDS诱导抑郁样行为。应激易感小鼠内侧前额叶皮质脑区E3泛素连接酶Nedd4l上调促进NRG1泛素化增加，导致NRG1蛋白水平降低，引起突触树突棘损伤，诱发应激所致小鼠抑郁样行为。下调Nedd4l阻止NRG1的降解进程，恢复NRG1水平，缓解CSDS所致抑郁样行为。本研究结果为抑郁症的发病机制提供新线索。