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研究背景与研究目的：Anillin(ANLN)一词源于西班牙语anillo，指“环”的意思。这是因为最初发现ANLN定位于细胞胞质分裂的收缩环中，从中发挥收缩环支架蛋白的作用。ANLN在哺乳动物中是保守的。近年有研究表明，ANLN除了在胞质分裂收缩环中发挥支架蛋白的作用外，其还在细胞粘附、细胞间连接，以及神经细胞的移动中发挥作用。另外，还有研究显示，肿瘤中ANLN异常高表达是潜在肿瘤分子标志物。然而，食管癌中，有关ANLN的表达特征、功能，及其临床意义如何，均尚不清楚。
大环内酯类化合物F806，是本实验室与福建省微生物研究所合作，在完成国家“863”微生物源新药筛选过程中，从土壤链霉菌FIM-04-806发酵液中提取分离获得的一种天然化合物。本实验室以往已经证明，F806具有很强的抑制食管癌恶性进展的活性，且对正常食管上皮细胞的毒性很低。为探究F806的抑制食管癌恶性进展的分子机制，我们通过分析蛋白质谱数据发现，ANLN在食管癌组织中异常高表达，经F806处理，食管癌细胞系ANLN显著下调表达，显示出ANLN可能是F806作用的靶点。基于此，本研究旨在深入探讨F806下调ANLN蛋白表达抑制食管癌恶性进展的分子机制，为以ANLN为靶点，将F806开发成抗食管癌的药物提供科学理论依据。
材料与方法：首先，应用免疫组织化学，对来自汕头市中心医院的食管癌组织样本288例，以及食管癌旁组织样本112例，检测ANLN的表达情况，同时分析ANLN表达与食管癌患者预后的关系。其次，应用E-plate细胞实时功能实验与细胞克隆形成实验，探究ANLN在食管癌细胞中的功能。再次，在确定ANLN为F806的潜在分子靶点的基础上，通过联合运用免疫印迹、免疫荧光和肿瘤异种移植等实验技术手段，进一步验证F806作用的确可显著下调食管癌细胞中ANLN蛋白表达。再者，以食管癌细胞为模型，应用流式细胞术、免疫荧光、胸腺嘧啶核苷双阻断法以及免疫印迹等实验方法，探究F806对ANLN在食管癌细胞中的定位，以及对细胞周期的影响。最后，应用免疫印迹，免疫共沉淀和计算机分子模拟对接等实验方法，深入探讨在食管癌细胞中，F806下调ANLN表达的分子机制。
研究结果：1.无论胞浆还是细胞核，ANLN蛋白在食管癌组织中的表达水平均明显高于其癌旁组织；而且，ANLN蛋白在食管癌组织中的表达水平，与患者的总生存期和无瘤生存期均显著负相关。2.多种食管癌细胞系中，ANLN蛋白表达水平均高于永生化食管上皮细胞系，且敲降ANLN表达能显著抑制食管癌细胞的增殖能力。3.F806处理食管癌细胞可显著下调ANLN蛋白表达；F806给药可使小鼠移植瘤中ANLN蛋白的水平显著降低；食管癌细胞经F806处理，ANLN蛋白水平呈剂量与时间依赖性降低，且诱导细胞发生凋亡。4.F806处理食管癌细胞，可明显抑制ANLN蛋白的周期性表达变化，而且还抑制ANLN蛋白在细胞赤道区以及收缩环的定位，同时还扰乱CyclinB1等其它细胞周期蛋白的周期性表达。5.利用放线菌酮阻断蛋白合成途径，发现F806仍然可以下调ANLN蛋白；随后，通过MG132抑制蛋白酶体途径，初步判定F806可能通过激活蛋白酶体途径促进ANLN蛋白降解。而进一步的实验结果显示，F806可促进ANLN蛋白泛素化修饰。6.干扰泛素连接酶共激活因子Cdh1能部分抑制F806诱导的ANLN降解，而且F806处理可增强Cdh1与ANLN相互作用。7.计算机分子模拟对接结果提示，F806可能与ANLN的PH结构域直接相互作用。
研究结论：1.检测食管癌组织中的ANLN蛋白，可作为评判食管癌患者总生存期和无瘤生存期的独立因子，具有预警食管癌患者预后的效能。2.F806处理通过干预ANLN蛋白显著抑制食管癌恶性进展，表明ANLN具有成为食管癌治疗的分子靶标的潜能。3.F806处理可抑制ANLN蛋白在食管癌细胞赤道区以及收缩环中的定位及其功能，并且通过泛素连接酶共激活因子Cdh1促进ANLN蛋白降解。
大环内酯类化合物F806，是本实验室与福建省微生物研究所合作，在完成国家“863”微生物源新药筛选过程中，从土壤链霉菌FIM-04-806发酵液中提取分离获得的一种天然化合物。本实验室以往已经证明，F806具有很强的抑制食管癌恶性进展的活性，且对正常食管上皮细胞的毒性很低。为探究F806的抑制食管癌恶性进展的分子机制，我们通过分析蛋白质谱数据发现，ANLN在食管癌组织中异常高表达，经F806处理，食管癌细胞系ANLN显著下调表达，显示出ANLN可能是F806作用的靶点。基于此，本研究旨在深入探讨F806下调ANLN蛋白表达抑制食管癌恶性进展的分子机制，为以ANLN为靶点，将F806开发成抗食管癌的药物提供科学理论依据。
材料与方法：首先，应用免疫组织化学，对来自汕头市中心医院的食管癌组织样本288例，以及食管癌旁组织样本112例，检测ANLN的表达情况，同时分析ANLN表达与食管癌患者预后的关系。其次，应用E-plate细胞实时功能实验与细胞克隆形成实验，探究ANLN在食管癌细胞中的功能。再次，在确定ANLN为F806的潜在分子靶点的基础上，通过联合运用免疫印迹、免疫荧光和肿瘤异种移植等实验技术手段，进一步验证F806作用的确可显著下调食管癌细胞中ANLN蛋白表达。再者，以食管癌细胞为模型，应用流式细胞术、免疫荧光、胸腺嘧啶核苷双阻断法以及免疫印迹等实验方法，探究F806对ANLN在食管癌细胞中的定位，以及对细胞周期的影响。最后，应用免疫印迹，免疫共沉淀和计算机分子模拟对接等实验方法，深入探讨在食管癌细胞中，F806下调ANLN表达的分子机制。
研究结果：1.无论胞浆还是细胞核，ANLN蛋白在食管癌组织中的表达水平均明显高于其癌旁组织；而且，ANLN蛋白在食管癌组织中的表达水平，与患者的总生存期和无瘤生存期均显著负相关。2.多种食管癌细胞系中，ANLN蛋白表达水平均高于永生化食管上皮细胞系，且敲降ANLN表达能显著抑制食管癌细胞的增殖能力。3.F806处理食管癌细胞可显著下调ANLN蛋白表达；F806给药可使小鼠移植瘤中ANLN蛋白的水平显著降低；食管癌细胞经F806处理，ANLN蛋白水平呈剂量与时间依赖性降低，且诱导细胞发生凋亡。4.F806处理食管癌细胞，可明显抑制ANLN蛋白的周期性表达变化，而且还抑制ANLN蛋白在细胞赤道区以及收缩环的定位，同时还扰乱CyclinB1等其它细胞周期蛋白的周期性表达。5.利用放线菌酮阻断蛋白合成途径，发现F806仍然可以下调ANLN蛋白；随后，通过MG132抑制蛋白酶体途径，初步判定F806可能通过激活蛋白酶体途径促进ANLN蛋白降解。而进一步的实验结果显示，F806可促进ANLN蛋白泛素化修饰。6.干扰泛素连接酶共激活因子Cdh1能部分抑制F806诱导的ANLN降解，而且F806处理可增强Cdh1与ANLN相互作用。7.计算机分子模拟对接结果提示，F806可能与ANLN的PH结构域直接相互作用。
研究结论：1.检测食管癌组织中的ANLN蛋白，可作为评判食管癌患者总生存期和无瘤生存期的独立因子，具有预警食管癌患者预后的效能。2.F806处理通过干预ANLN蛋白显著抑制食管癌恶性进展，表明ANLN具有成为食管癌治疗的分子靶标的潜能。3.F806处理可抑制ANLN蛋白在食管癌细胞赤道区以及收缩环中的定位及其功能，并且通过泛素连接酶共激活因子Cdh1促进ANLN蛋白降解。