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目的:探索重组蛇毒精氨酸酯酶His-Agkihpin体外对肝癌细胞生物学行为的影响,研究相关基因改变;进一步探索His-Agkihpin体内抗肝癌效应。以期发现His-Agkihpin的相关抗肝癌药理作用,为其抗肝癌提供实验依据。方法:1、体外培养肝癌细胞SMMC-7721、HepG2及肝细胞LO2、CCL13肝细胞。(1)用不同浓度(16.52μg/ml、11.68μg/ml、8.26μg/ml、5.84μg/ml、4.13μg/ml)的His-Agkihpin作用24 h、48 h、72 h后,CCK-8法检测细胞增殖,并计算IC50,比较His-Agkihpin对不同肝癌细胞及肝细胞的增殖影响;确定His-Agkihpin作用肝癌细胞的最佳时间及浓度。(2)显微镜观察His-Agkihpin对肝癌细胞SMMC-7721、HepG2及肝细胞LO2、CCL13作用后,细胞形态的变化。(3)流式细胞术检测His-Agkihpin对肝癌细胞SMMC-7721、HepG2和肝细胞LO2、CCL13的凋亡及周期影响情况。(4)采用划痕实验及Transwell迁移实验检测His-Agkihpin对肝癌细胞SMMC-7721、HepG2的迁移能力的影响。2、采用q RT-PCR(Real time fluorescence quantitative-PCR)检测Ki-67和Cyclin B1等分子的mRNA水平在一定浓度的His-Agkihpin作用后SMMC-7721、Hep G2细胞中的变化,初步分析His-Agkihpin作用人肝癌SMMC-7721、HepG2细胞的机制。3、用Hep G2等细胞进行裸鼠成瘤实验,观察His-Agkihpin体内对于肝癌细胞的影响。结果:1、各浓度组His-Agkihpin作用SMMC-7721、HepG2后,细胞的增殖抑制率均上升,并呈现一定程度的浓度依赖效应,His-Agkihpin浓度越高,抑制率越高。除了16.52μg/ml的His-Agkihpin对CCL13有较明显的抑制作用,而其余各浓度组均无明显抑制作用;各浓度组His-Agkihpin对L02均有轻微促增殖作用。His-Agkihpin作用SMMC-7721的IC50为8.88μg/ml,His-Agkihpin作用HepG2的IC50为13.62μg/ml。其中浓度为11.68μg/ml的His-Agkihpin对SMMC-7721、HepG2有明显的增殖抑制作用(P<0.05),而对正常肝细胞无明显影响。2、His-Agkihpin对SMMC-7721、HepG2及LO2、CCL13细胞的形态变化均无明显影响。3、流式细胞术检测His-Agkihpin对细胞的促凋亡作用。各浓度His-Agkihpin和NS对L-02、CCL13的凋亡基本无影响。11.68μg/ml His-Agkihpin对SMMC-7721的促凋亡率为38.00%,高于NS组的6.30%(P<0.05);对HepG2,促凋亡率为15.10%,高于NS组的1.60%(P<0.05)。4、流式细胞术检测His-Agkihpin对细胞周期的影响。各浓度His-Agkihpin作用后的SMMC-7721、HepG2细胞后,主要阻滞细胞于G2期,其中11.68μg/ml的His-Agkihpin对SMMC-7721 G2期阻滞率最高,为45.7%(P<0.05);对HepG2 G2期的阻滞率也达45.9%(P<0.05)。各浓度His-Agkihpin对L-02、CCL13周期影响无明显变化。5、划痕实验检测His-Agkihpin对SMMC-7721、HepG2迁移能力的影响。NS作用HepG2 24~48h划痕愈合率为16.79~16.99%,SMMC-7721 24~48h划痕愈合率为20.67~25.05%。而His-Agkihpin作用HepG2 24~48h后的划痕愈合率为0.65~1.54%,SMMC-7721 24~48h划痕愈合率为0.74~8.36%。可见,His-Agkihpin抑制肝癌细胞的划痕愈合。6、Transwell实验检测His-Agkihpin对SMMC-7721、HepG2迁移能力的影响。His-Agkihpin作用的SMMC-7721、HepG2穿越聚碳酸酯膜的细胞数少,细胞迁移能力比NS组弱(P<0.05)。7、qRT-PCR检测His-Agkihpin对SMMC-7721、HepG2中Ki-67和Cyclin B1的mRNA的变化。结果显示SMMC-7721、HepG2中Ki-67 mRNA的相对转录水平低于NS组(P<0.05),Cyclin B1 mRNA极轻微低于NS组(P>0.05)。8、用HepG2进行裸鼠人肝癌造模,观察His-Agkihpin、5-Fu和NS对裸鼠瘤体生长变化,取瘤体称重。结果显示,His-Agkihpin组移植瘤的生长曲线增长幅度、瘤体体积及瘤重均较明显小于NS组及5-Fu组。结论:1、11.68μg/ml的重组蛇毒精氨酸酯酶His-Agkihpin能抑制肝癌细胞HepG2、SMMC-7721增殖,有较明显的促凋亡作用,可将HepG2、SMMC-7721阻滞于G2期,而对肝细胞L-02、CCL13无类似作用。对肝癌细胞Hep G2、SMMC-7721抑制迁移的作用。不改变肝癌细胞HepG2、SMMC-7721及肝细胞L-02、CCL13的细胞形态。2、11.68μg/ml的His-Agkihpin可下调肝癌细胞SMMC-7721、HepG2中的Ki-67 mRNA水平;细胞中Cyclin B1 mRNA水平微弱下调。3、11.68μg/ml的His-Agkihpin可抑制裸鼠中人肝癌细胞HepG2移植瘤生长。该浓度的His-Agkihpin将来有望作为抑制肝癌生长的药物。