微囊藻毒素（Microcystins,MCs）是淡水蓝藻破裂后产生的一类单环七肽天然毒素,具有肝毒性、肾毒性、神经毒性和胃肠道毒性等。本实验室率先发现MC-LR（水体中分布最广、毒性最强的一种MCs异构体）具有雄性生殖毒性,能够引起血清中睾酮水平下降。实验室前期研究发现MC-LR不能进入睾酮的生成场所间质细胞对其产生毒性作用,而是通过进入下丘脑促性腺激素释放激素（GnRH）神经元,影响GnRH的合成和分泌,经由下丘脑-垂体-睾丸轴间接调控睾酮生成,并且确定有机阴离子转运多肽1a5（Oatp1a5）是介导MC-LR进入GnRH神经元的关键转运蛋白。本课题中,我们从Oatp1a5的蛋白结构出发,探讨Oatp1a5介导MC-LR进入GT1-7细胞（具有成熟GnRH神经元特性的永生化细胞系）的转运机制。研究表明,跨膜区域是膜蛋白结合并转运底物的关键部位,我们通过生物信息学工具及文献检索对Oatp1a5的跨膜区域（TM）进行初步筛选,确定了 TM2、TM4、TM6、TM8、TM9、TM10为主要研究对象。通过基因克隆技术构建野生型Oatp1a5过表达质粒,并通过基因定点突变技术及Western Blot证明了 TM2、TM8、TM9为Oatp1a5转运MC-LR进入GT1-7细胞的主要跨膜区域。另外,我们发现Oatp1a5的N糖基化对其转运MC-LR进入细胞的能力十分重要,抑制N糖基化后,MC-LR进入细胞的量明显减少。通过生物信息学在线分析软件,预测到Oatp1a5具有5个潜在的N糖基化位点,分别为第62位、124位、135位、483位及492位天冬酰胺。之后,我们通过单位点突变,确定第483及492位N糖基化位点为Oatp1a5转运MC-LR进入GT1-7细胞的主要位点。综上所述,本研究进一步加深了我们对MC-LR进入GnRH神经元机制的认识,为预防MC-LR损害男性生殖健康奠定了理论基础。本研究的特色与创新之处:1.本研究首次发现Oatp1a5的TM2,TM8,TM9是其转运MC-LR进入GT1-7细胞中的主要跨膜区域。2.率先发现Oatp1a5的N糖基化参与其转运MC-LR进入细胞的过程。3.采用生物信息学工具,预测到Oatp1a5具有5个潜在的N糖基化位点,并且经过进一步研究,确定第483及492位天冬酰胺是Oatp1a5转运MC-LR进入GT1-7细胞中的主要N糖基化位点。