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目的：阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)是当下发病率相对较高且以睡眠呼吸障碍为特点的一类疾病，同时也是心脑血管相关疾病发生发展的相对独立危险因素。间歇性低氧(IH)等病理生理学改变是OSAHS疾病的主要特征，其可导致体内反复发生低氧/复氧的周期性循环过程，最终导致血管内皮细胞损伤。心脑血管相关疾病作为中老年OSAHS患者较常见的并发症之一，其发病机制可能与间歇性低氧所导致的血管内皮细胞损伤有关。
近年来大量研究发现miRNAs的表达变化与自噬在缺血和(或)缺氧所致的组织细胞损伤中发挥至关重要的作用。然而在间歇性低氧条件下，miRNAs参与自噬激活的具体机制以及自噬对血管系统损伤所产生的影响尚有待于进一步研究。
因此，本研究首先收集临床资料，筛选OSAHS患者和健康对照人群血浆外泌体中与细胞自噬、凋亡相关的差异表达的miRNAs，并分析其对冠状动脉内皮细胞自噬、凋亡的影响。在此基础上，进一步体外模拟OSAHS病理生理学特征建立间歇性低氧细胞与动物模型，从体内、外实验研究的角度分析miR-34a在间歇性低氧诱导血管内皮细胞损伤尤其自噬和凋亡中的作用及机制，并进一步研究外源基因靶向干预对间歇性低氧所导致血管内皮细胞损伤及自噬流变化的影响，从而深入研究自噬激活在间歇性低氧所致血管内皮细胞损伤中的作用。
方法：
1OSAHS患者和健康对照人群血浆外泌体中miRNAs的表达及差异化miRNA筛选
1.1选取就诊于河北医科大学第二医院且经多导睡眠监测确诊的OSAHS患者，诊断符合年龄2015年修订的《阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合症诊治指南》，入组后对患者进行病情分级，比较各组间体重指数、呼吸暂停低通气指数(Apnea-Hypoapnea index)、最低血氧饱和度(LSaO2)、平均血氧饱和度(MSaO2)等一般资料的差异；
1.2收集OSAHS和对照组全血5ml，分离血浆外泌体，采用实时荧光定量PCR技术检测外泌体与自噬、凋亡相关的miRNA(miR-93、miR-672、miR-181、miR-34a、miR-24、miR-103、miR-709、miR-122和miR-665的表达变化；同时比较外泌体与去除外泌体血浆中miR-34a的差异；
1.3将常规培养的人冠状动脉内皮细胞(HCAECs )分别给予或不给予miR-34ainhibitor预处理后采用间歇性低氧和外泌体处理，实时荧光定量PCR检测miR-34a的表达，AO、TUNEL染色及westernblot等技术检测自噬、凋亡及相关蛋白的表达变化。
2探讨miR-34a在体外间歇性低氧所致HCAECs细胞自噬和凋亡中的作用及可能机制
2.1为了模拟不同严重程度的OSAHS所导致的机体缺氧状态，体外实验给予HCAECs细胞不同氧气浓度(21%、10%、5%和1%)干预，24h后收取细胞蛋白；同时给予HCAECs细胞21%、1%的氧气环境干预不同时间(0、6、12、24 h)后提取细胞总蛋白，Westernblot检测Vps34、Atg5、LC3、p62、Bcl-2的表达，qRT-PCR检测SQSTM1/p62mRNA和miR-34a的变化，AO、MDC和TUNEL染色等技术检测自噬和凋亡情况；
2.2为了验证Beclin1在间歇性低氧诱导的HCAECs细胞自噬和凋亡中的作用，将常规培养的HCAECs细胞给予Beclin1抑制剂Spautin1预处理，然后给予低氧干预，24h收集细胞，进行自噬、凋亡及相关蛋白的检测；
2.3双荧光素酶报告基因分析验证Bcl-2是miR-34a的靶基因；
2.4为了验证miR-34a在间歇性低氧诱导的自噬中的确切作用，应用anti-miR-34a和anti-miR-NC转染HCAECs细胞后，在1%的低氧环境下培养24h，应用qRT-PCR检测HCAECs细胞内miR-34a的表达水平，westernblot检测HCAECs细胞内Bcl-2、Beclin1、Vps34、Atg5、LC3和p62等的表达变化；
2.5为了明确Bcl-2、Beclin1在间歇性低氧诱导的自噬和凋亡中的确切作用，通过pCDNA-Bcl-2过表达Bcl-2和敲低Beclin1，在1%的低氧环境下培养24h，westernblot检测HCAECs细胞内Bcl-2、Beclin1、Vps34、Atg5、LC3和p62等的表达变化；
2.6同时敲低Bcl-2和(或)抑制miR-34a，检测自噬、凋亡蛋白的相关变化，明确miR-34a-Bcl-2-Beclin1与自噬、凋亡的关系。
3尾静脉注射miR-34a抑制剂(antagomir)/激动剂(agomir)对OSAHS小鼠模型动脉粥样硬化形成的影响
建立间歇性低氧动物模型，将实验动物分为四组(正常对照组、阴性对照组、Antagomir组及Agomir组)，分别于造模前、后测得最各组最低血氧饱和度、体重、体长、Lee’s指数；留取血标本和主动脉，分别qRT-PCR、westernblot、油红O染色等技术检测血脂、miR-34a、Bcl-2的变化、动脉脂质沉积成情况，比较分析miR-34a表达变化与脂质沉积面积的相关性。
结果：
1重度OSAHS患者异常分泌的血浆外泌体内高表达的miR-34a可能通过影响Bcl-2与Beclin1的表达，促进冠状动脉内皮细胞自噬与凋亡的发生。
1.1重度OSAHS患者血浆中外泌体分泌增多，且外泌体中miR-34a的表达也显著上调。
重度OSAHS组体质量指数明显高于对照组，且OSAHS组随着鼾症程度增加LSaO2、MSaO2逐渐下降。且外泌体标志蛋白(CD63、CD81和CD9)在重度OSAHS组表达明显高于Control组；同时重度OSAHS组外泌体中miR-34a表达显著高于对照组。
1.2重度OSAHS患者血浆外泌体可上调间歇性低氧处理的HCAECs细胞内miR-34a表达，相继通过影响Bcl-2与Beclin1的表达，促进细胞自噬和凋亡的发生。
1.2.1应用重度OSAHS组血浆外泌体干预1%间歇性低氧处理的HCAECs细胞，细胞中Beclin1、Vps34、Atg5、LC3、Bax、cleaved-PARP、cleaved-caspase-9及cleaved-caspase-3蛋白的表达明显升高，且细胞自噬和凋亡率明显上调，同时p62和Bcl-2表达降低；
1.2.2miR-34ainhibitor预处理后再给予OSAHS组血浆外泌体和间歇性低氧刺激，miR-34ainhibitor逆转了外泌体/间歇性低氧诱导的自噬和凋亡的升高，相关蛋白表达也得到了改善。
2miR-34a在间歇性低氧诱导的HCAECs细胞自噬和凋亡中的作用及可能机制
2.1Beclin1参与CIH诱导的HCAECs细胞自噬和细胞凋亡：
随着氧含量的降低和低氧处理时间的延长，自噬相关蛋白Vps34、Atg5、LC3的表达增强，自噬和凋亡率明显升高p62表达则与之相反；而与单纯间歇性低氧处理组相比，低氧联合Spautin1抑制组自噬和凋亡率降低。
应用siRNA对Beclin1进行干扰，发现低氧联合Beclin1siRNA转染组中Beclin1的表达明显受到抑制，其下游Vps34、Atg5、LC3的表达也随之表达下调，而p62的表达呈现表达上调的趋势。
2.2在间歇性低氧环境下，miR-34a通过抑制靶基因Bcl-2的表达介导HCAECs自噬和凋亡的发生：
qRT-PCR结果显示：随着低氧作用时间的延长，HCAECs细胞内miR-34a的表达逐渐增加，12h与24h时作用尤为明显，与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。Westernblot检测其下游靶基因Bcl-2表达随之降低。双荧光素酶报告基因结果显示：在间歇性低氧环境处理的HCAECs中，Bcl-2是miR-34a的靶基因。
同时采用miR-34ainhibitor预处理细胞，给予间歇性低氧处理，实施定量PCR和Westernblot检测结果显示：抑制miR-34a表达可抑制1%的低氧环境下培养的HCAECs细胞Vps34、Atg5、LC3表达水平的升高和p62表达水平降低(P<0.05)。基因转染高表达Bcl-2水平后可以显著抑制1%低氧环境下培养所致HCAECs细胞中Bcl-2和p62水平降低，Beclin1、Vps34、Atg5、LC3水平升高；而当miR-34ainhibitor与Bcl-2siRNA联合作用时，Bcl-2siRNA可逆转下调miR-34a所导致的自噬相关蛋白的降低。
3尾静脉注射miR-34aantagomir/agomir对OSAHS小鼠模型动脉粥样硬化形成的影响
3.1检测得Antagomir组、Agomir组、阴性对照(Negtive control)组小鼠体重和Lee’s指数均高于正常对照组(Control)。
3.2与正常对照组相比，阴性对照组miR-34a表达显著升高，而Antagomir治疗可降低OSAHS小鼠血浆中miR-34a表达，Agomir处理组miR-34a表达显著高于阴性对照组。
3.3血脂检测结果显示：与Control组相比，阴性对照组血清中TG、TC和LDL-C水平显著升高，而HDL-C水平下降；而Antagomir治疗能够改善OSAHS小鼠高血脂状态，Agomir处理组血脂升高更为明显。
3.4与正常组相比，阴性对照组血管组织中Bcl-2蛋白表达降低，而Antagomir治疗组小鼠主动脉Bcl-2蛋白表达较阴性对照组(仅有AS)升高，Agomir组动脉组织中Bcl-2蛋白表达降低更明显。油红O染色和脂质沉积面积定量测定结果显示：OSAHS小鼠(阴性对照组)主动脉可见明显的脂质沉积，Antagomir治疗组主动脉脂质沉积明显减少，而Agomir干预后小鼠主动脉及主动脉根部脂质沉积较阴性对照组明显增多，相关性分析显示：小鼠动脉脂质沉积面积与OSAHS鼠血浆中miR-34a的相对表达水平之间呈正相关(r=0.6943，P=0.0122)。
结论：
1.重度OSAHS患者异常分泌的血浆外泌体内高表达的miR-34a可能通过影响Bcl-2与Beclin1的表达，促进冠状动脉内皮细胞自噬与凋亡的发生。
2.间断性低氧通过上调miR-34a过表达，靶向抑制Bcl-2的转录，上调自噬相关蛋白的表达，介导冠状动脉内皮细胞自噬的发生。
3.间断性低氧可促进冠状动脉内皮细胞过度自噬，从而导致细胞发生凋亡。
4.抑制OSAHS模型鼠miR-34a的表达，能够明显减轻内皮细胞损伤和小鼠动脉粥样硬化的形成，提示miR-34a可能作为治疗或逆转OSAHS患者血管损伤的作用靶点。
近年来大量研究发现miRNAs的表达变化与自噬在缺血和(或)缺氧所致的组织细胞损伤中发挥至关重要的作用。然而在间歇性低氧条件下，miRNAs参与自噬激活的具体机制以及自噬对血管系统损伤所产生的影响尚有待于进一步研究。
因此，本研究首先收集临床资料，筛选OSAHS患者和健康对照人群血浆外泌体中与细胞自噬、凋亡相关的差异表达的miRNAs，并分析其对冠状动脉内皮细胞自噬、凋亡的影响。在此基础上，进一步体外模拟OSAHS病理生理学特征建立间歇性低氧细胞与动物模型，从体内、外实验研究的角度分析miR-34a在间歇性低氧诱导血管内皮细胞损伤尤其自噬和凋亡中的作用及机制，并进一步研究外源基因靶向干预对间歇性低氧所导致血管内皮细胞损伤及自噬流变化的影响，从而深入研究自噬激活在间歇性低氧所致血管内皮细胞损伤中的作用。
方法：
1OSAHS患者和健康对照人群血浆外泌体中miRNAs的表达及差异化miRNA筛选
1.1选取就诊于河北医科大学第二医院且经多导睡眠监测确诊的OSAHS患者，诊断符合年龄2015年修订的《阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合症诊治指南》，入组后对患者进行病情分级，比较各组间体重指数、呼吸暂停低通气指数(Apnea-Hypoapnea index)、最低血氧饱和度(LSaO2)、平均血氧饱和度(MSaO2)等一般资料的差异；
1.2收集OSAHS和对照组全血5ml，分离血浆外泌体，采用实时荧光定量PCR技术检测外泌体与自噬、凋亡相关的miRNA(miR-93、miR-672、miR-181、miR-34a、miR-24、miR-103、miR-709、miR-122和miR-665的表达变化；同时比较外泌体与去除外泌体血浆中miR-34a的差异；
1.3将常规培养的人冠状动脉内皮细胞(HCAECs )分别给予或不给予miR-34ainhibitor预处理后采用间歇性低氧和外泌体处理，实时荧光定量PCR检测miR-34a的表达，AO、TUNEL染色及westernblot等技术检测自噬、凋亡及相关蛋白的表达变化。
2探讨miR-34a在体外间歇性低氧所致HCAECs细胞自噬和凋亡中的作用及可能机制
2.1为了模拟不同严重程度的OSAHS所导致的机体缺氧状态，体外实验给予HCAECs细胞不同氧气浓度(21%、10%、5%和1%)干预，24h后收取细胞蛋白；同时给予HCAECs细胞21%、1%的氧气环境干预不同时间(0、6、12、24 h)后提取细胞总蛋白，Westernblot检测Vps34、Atg5、LC3、p62、Bcl-2的表达，qRT-PCR检测SQSTM1/p62mRNA和miR-34a的变化，AO、MDC和TUNEL染色等技术检测自噬和凋亡情况；
2.2为了验证Beclin1在间歇性低氧诱导的HCAECs细胞自噬和凋亡中的作用，将常规培养的HCAECs细胞给予Beclin1抑制剂Spautin1预处理，然后给予低氧干预，24h收集细胞，进行自噬、凋亡及相关蛋白的检测；
2.3双荧光素酶报告基因分析验证Bcl-2是miR-34a的靶基因；
2.4为了验证miR-34a在间歇性低氧诱导的自噬中的确切作用，应用anti-miR-34a和anti-miR-NC转染HCAECs细胞后，在1%的低氧环境下培养24h，应用qRT-PCR检测HCAECs细胞内miR-34a的表达水平，westernblot检测HCAECs细胞内Bcl-2、Beclin1、Vps34、Atg5、LC3和p62等的表达变化；
2.5为了明确Bcl-2、Beclin1在间歇性低氧诱导的自噬和凋亡中的确切作用，通过pCDNA-Bcl-2过表达Bcl-2和敲低Beclin1，在1%的低氧环境下培养24h，westernblot检测HCAECs细胞内Bcl-2、Beclin1、Vps34、Atg5、LC3和p62等的表达变化；
2.6同时敲低Bcl-2和(或)抑制miR-34a，检测自噬、凋亡蛋白的相关变化，明确miR-34a-Bcl-2-Beclin1与自噬、凋亡的关系。
3尾静脉注射miR-34a抑制剂(antagomir)/激动剂(agomir)对OSAHS小鼠模型动脉粥样硬化形成的影响
建立间歇性低氧动物模型，将实验动物分为四组(正常对照组、阴性对照组、Antagomir组及Agomir组)，分别于造模前、后测得最各组最低血氧饱和度、体重、体长、Lee’s指数；留取血标本和主动脉，分别qRT-PCR、westernblot、油红O染色等技术检测血脂、miR-34a、Bcl-2的变化、动脉脂质沉积成情况，比较分析miR-34a表达变化与脂质沉积面积的相关性。
结果：
1重度OSAHS患者异常分泌的血浆外泌体内高表达的miR-34a可能通过影响Bcl-2与Beclin1的表达，促进冠状动脉内皮细胞自噬与凋亡的发生。
1.1重度OSAHS患者血浆中外泌体分泌增多，且外泌体中miR-34a的表达也显著上调。
重度OSAHS组体质量指数明显高于对照组，且OSAHS组随着鼾症程度增加LSaO2、MSaO2逐渐下降。且外泌体标志蛋白(CD63、CD81和CD9)在重度OSAHS组表达明显高于Control组；同时重度OSAHS组外泌体中miR-34a表达显著高于对照组。
1.2重度OSAHS患者血浆外泌体可上调间歇性低氧处理的HCAECs细胞内miR-34a表达，相继通过影响Bcl-2与Beclin1的表达，促进细胞自噬和凋亡的发生。
1.2.1应用重度OSAHS组血浆外泌体干预1%间歇性低氧处理的HCAECs细胞，细胞中Beclin1、Vps34、Atg5、LC3、Bax、cleaved-PARP、cleaved-caspase-9及cleaved-caspase-3蛋白的表达明显升高，且细胞自噬和凋亡率明显上调，同时p62和Bcl-2表达降低；
1.2.2miR-34ainhibitor预处理后再给予OSAHS组血浆外泌体和间歇性低氧刺激，miR-34ainhibitor逆转了外泌体/间歇性低氧诱导的自噬和凋亡的升高，相关蛋白表达也得到了改善。
2miR-34a在间歇性低氧诱导的HCAECs细胞自噬和凋亡中的作用及可能机制
2.1Beclin1参与CIH诱导的HCAECs细胞自噬和细胞凋亡：
随着氧含量的降低和低氧处理时间的延长，自噬相关蛋白Vps34、Atg5、LC3的表达增强，自噬和凋亡率明显升高p62表达则与之相反；而与单纯间歇性低氧处理组相比，低氧联合Spautin1抑制组自噬和凋亡率降低。
应用siRNA对Beclin1进行干扰，发现低氧联合Beclin1siRNA转染组中Beclin1的表达明显受到抑制，其下游Vps34、Atg5、LC3的表达也随之表达下调，而p62的表达呈现表达上调的趋势。
2.2在间歇性低氧环境下，miR-34a通过抑制靶基因Bcl-2的表达介导HCAECs自噬和凋亡的发生：
qRT-PCR结果显示：随着低氧作用时间的延长，HCAECs细胞内miR-34a的表达逐渐增加，12h与24h时作用尤为明显，与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。Westernblot检测其下游靶基因Bcl-2表达随之降低。双荧光素酶报告基因结果显示：在间歇性低氧环境处理的HCAECs中，Bcl-2是miR-34a的靶基因。
同时采用miR-34ainhibitor预处理细胞，给予间歇性低氧处理，实施定量PCR和Westernblot检测结果显示：抑制miR-34a表达可抑制1%的低氧环境下培养的HCAECs细胞Vps34、Atg5、LC3表达水平的升高和p62表达水平降低(P<0.05)。基因转染高表达Bcl-2水平后可以显著抑制1%低氧环境下培养所致HCAECs细胞中Bcl-2和p62水平降低，Beclin1、Vps34、Atg5、LC3水平升高；而当miR-34ainhibitor与Bcl-2siRNA联合作用时，Bcl-2siRNA可逆转下调miR-34a所导致的自噬相关蛋白的降低。
3尾静脉注射miR-34aantagomir/agomir对OSAHS小鼠模型动脉粥样硬化形成的影响
3.1检测得Antagomir组、Agomir组、阴性对照(Negtive control)组小鼠体重和Lee’s指数均高于正常对照组(Control)。
3.2与正常对照组相比，阴性对照组miR-34a表达显著升高，而Antagomir治疗可降低OSAHS小鼠血浆中miR-34a表达，Agomir处理组miR-34a表达显著高于阴性对照组。
3.3血脂检测结果显示：与Control组相比，阴性对照组血清中TG、TC和LDL-C水平显著升高，而HDL-C水平下降；而Antagomir治疗能够改善OSAHS小鼠高血脂状态，Agomir处理组血脂升高更为明显。
3.4与正常组相比，阴性对照组血管组织中Bcl-2蛋白表达降低，而Antagomir治疗组小鼠主动脉Bcl-2蛋白表达较阴性对照组(仅有AS)升高，Agomir组动脉组织中Bcl-2蛋白表达降低更明显。油红O染色和脂质沉积面积定量测定结果显示：OSAHS小鼠(阴性对照组)主动脉可见明显的脂质沉积，Antagomir治疗组主动脉脂质沉积明显减少，而Agomir干预后小鼠主动脉及主动脉根部脂质沉积较阴性对照组明显增多，相关性分析显示：小鼠动脉脂质沉积面积与OSAHS鼠血浆中miR-34a的相对表达水平之间呈正相关(r=0.6943，P=0.0122)。
结论：
1.重度OSAHS患者异常分泌的血浆外泌体内高表达的miR-34a可能通过影响Bcl-2与Beclin1的表达，促进冠状动脉内皮细胞自噬与凋亡的发生。
2.间断性低氧通过上调miR-34a过表达，靶向抑制Bcl-2的转录，上调自噬相关蛋白的表达，介导冠状动脉内皮细胞自噬的发生。
3.间断性低氧可促进冠状动脉内皮细胞过度自噬，从而导致细胞发生凋亡。
4.抑制OSAHS模型鼠miR-34a的表达，能够明显减轻内皮细胞损伤和小鼠动脉粥样硬化的形成，提示miR-34a可能作为治疗或逆转OSAHS患者血管损伤的作用靶点。