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鸡球虫病是一种或多种艾美耳球虫寄生于鸡肠上皮细胞而导致鸡消化道损伤的一种原虫病，严重制约着家禽养殖业的发展。鸡球虫种类众多，不同球虫寄生部位也各异，在掠夺宿主营养同时造成消化道损伤，多种艾美耳球虫中以柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella，E.tenella)对养禽业发展影响最为严重。针对该病防治目前仍依赖于化学药物，但药物残留和耐药虫株问题限制其使用，而市场上销售的活虫疫苗也存在返毒的危险。因此，探索新型、安全、稳定的球虫疫苗势在必行。研究发现，植物乳杆菌作为益生菌，可长期稳定定植于肠道，并且具有易培养、免疫调节等特点使之成为口服疫苗的理想载体。经改造表达金黄色葡萄球菌侵袭蛋白FnBPA蛋白的植物乳杆菌，其黏附侵袭能力增加，表达球虫相关抗原蛋白，更容易被机体免疫系统识别从而诱导相应的免疫反应。E.tenella表面抗原TA4和顶膜抗原AMA1在鸡球虫不同发育阶段发挥重要作用，抗原的免疫原性已被证实。本研究将TA4和AMA1抗原基因锚定于表达FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌表面，构建了表达双抗原的重组侵入型植物乳杆菌NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-TA4-AMA1，并通过动物实验对重组侵入型植物乳杆菌抗E.tenalla感染的保护效果进行了评价。具体研究内容及结果如下：
首先对侵入型乳酸菌的安全性进行研究，高剂量侵入型乳酸菌口服免疫雏鸡，观察一周内鸡体重变化，一周后取脏器进行称重并对脏器指数进行计算，取肝、脾、肺和小肠制作石蜡切片观察病理变化，结果表明侵入型乳酸菌免疫雏鸡后体重、脏器指数、石蜡切片均正常，侵入型植物乳杆菌具有安全性。因AMA1纯化蛋白和多克隆抗体由实验室提供，因此只对TA4蛋白进行纯化并与佐剂混合后免疫小鼠制备多克隆抗体，通过ELISA方法检测抗体滴度为1:32000。随后进行重组质粒的构建，融合PCR将TA4与AMA1抗原使用Linker序列进行连接，运用基因工程技术分别将TA4、AMA1、TA4-AMA1基因连接至原核表达质粒pSIP409-pgsA’，设计引物将锚定展示元件聚-γ-谷氨酸合成酶A(Poly-γ-GlutamicAcidSynthetaseA，pgsA)片段pgsA’与抗原序列一同扩增，再克隆至pSIP409-FnBPA质粒，转入Top10感受态中扩增，纯化质粒进行酶切、测序鉴定后，转入植物乳杆菌NC8菌株中，酶切及测序验证结果表面成功构建三株重组乳酸菌NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-TA4、NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-AMA1、NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-TA4-AMA1。WesternBlot验证重组乳酸菌目的表达，结果可分别再55KDa、70KDa、100KDa检测到目的蛋白的表达。为评估重组乳酸菌的侵袭能力，使重组菌感染鸡胚成纤维细胞(CEF)检测重组菌的侵袭率，结果显示NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-TA4侵袭率为0.20%，NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-AMA1pSIP409-FnBPA-pgsA’-TA4-AMA1侵袭率为0.21%，对照菌NC8pSIP409-pgsA’侵袭率为0.02%，NC8pSIP409-FnBPA侵袭率为0.40%，虽然共表达抗原会影响重组菌的侵袭率，但是仍显著高于对照组(P＜0.001，P＜0.01)。
1日龄雏鸡被随机分为五个对照组：生理盐水组(Saline)、攻虫组(Challenge)、NC8pSIP409-pgsA’组(pgsA’)、NC8pSIP409-FnBPA组(FnBPA)、商品化弱毒疫苗组(Viccine)；和四个重组乳酸菌组：NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-TA4组(TA4)、NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-TA4-AMA1组(TA4-AMA1)和混合免疫的NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-TA4+NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-AMA1组(TA4+AMA1)。分别于3、4、5、17、18、19日龄进行口服免疫，免疫剂量为1×109CFU/200μl，30日龄时，除Saline组，其余组每只鸡口服接种1×105个E.tenella孢子化卵囊。
在攻虫前，使用ELISA方法检测血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、特异性IgG的含量，以及肠道灌洗液特异性sIgA水平，MTT法检测脾脏淋巴细胞的增殖情况，同时使用流式细胞术检测攻虫前后外周血淋巴细胞中CD3+CD4+和CD3+CD8+淋巴细胞分化情况和盲肠扁桃体淋巴细胞中B淋巴细胞含量。在攻虫后，统计相对增重率、卵囊排出量、盲肠病变计分等保护指标并分析。
分析动物实验数据，ELISA结果显示单表达抗原组血清中检测到特异性IgG显著高于Saline组和空载体组(P＜0.001，P＜0.01)，TA4-AMA1组与单表达抗原组差异不显著(P＞0.05)；特异性sIgA水平重组乳酸菌组也显著高于Saline和空载体组(P＜0.001，P＜0.01)；血清中细胞因子检测，表明TA4-AMA1组的IFN-γ、IL-2、IL-4含量高于其他实验组，显著高于对照组(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05)。使用纯化后的TA4、AMA1蛋白与脾淋巴细胞共培养，检测淋巴细胞特异性增殖能力，结果可见单表达抗原的TA4和AMA1组淋巴细胞增殖结果显著高于其他组(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05)。免疫重组乳酸菌后，TA4-AMA1组可诱导外周血淋巴细胞中高水平的CD3+CD8+细胞水平，而CD3+CD4+淋巴细胞水平最高为AMA1组。攻虫后，TA4-AMA1和TA4+AMA1组体重增长明显，相对增重率分别为89.64%和84.31%；卵囊减少率最高为Vaccine组，为80.35%，其次为TA4+AMA1组，卵囊减少率为67.50%；剖检发现TA4-AMA1和TA4+AMA1组盲肠病变较轻，病变计分均为0.5，显著低于Challenge组(P＜0.001)和对照组(P＜0.05)。TA4、AMA1、TA4-AMA1、TA4+AMA1组的ACI指数分别为144.83、142.59、174.64和169.31，NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-TA4-AMA1抗球虫效果最佳。
本研究结果表明使用表达FnBPA的侵入型植物乳杆菌作为载体，共表达E.tenella的表面抗原TA4和顶膜抗原AMA1免疫雏鸡，提高机体细胞免疫和体液免疫水平，并能提高雏鸡对球虫的抵抗力，为鸡球虫病的防治提供新的思路。
首先对侵入型乳酸菌的安全性进行研究，高剂量侵入型乳酸菌口服免疫雏鸡，观察一周内鸡体重变化，一周后取脏器进行称重并对脏器指数进行计算，取肝、脾、肺和小肠制作石蜡切片观察病理变化，结果表明侵入型乳酸菌免疫雏鸡后体重、脏器指数、石蜡切片均正常，侵入型植物乳杆菌具有安全性。因AMA1纯化蛋白和多克隆抗体由实验室提供，因此只对TA4蛋白进行纯化并与佐剂混合后免疫小鼠制备多克隆抗体，通过ELISA方法检测抗体滴度为1:32000。随后进行重组质粒的构建，融合PCR将TA4与AMA1抗原使用Linker序列进行连接，运用基因工程技术分别将TA4、AMA1、TA4-AMA1基因连接至原核表达质粒pSIP409-pgsA’，设计引物将锚定展示元件聚-γ-谷氨酸合成酶A(Poly-γ-GlutamicAcidSynthetaseA，pgsA)片段pgsA’与抗原序列一同扩增，再克隆至pSIP409-FnBPA质粒，转入Top10感受态中扩增，纯化质粒进行酶切、测序鉴定后，转入植物乳杆菌NC8菌株中，酶切及测序验证结果表面成功构建三株重组乳酸菌NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-TA4、NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-AMA1、NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-TA4-AMA1。WesternBlot验证重组乳酸菌目的表达，结果可分别再55KDa、70KDa、100KDa检测到目的蛋白的表达。为评估重组乳酸菌的侵袭能力，使重组菌感染鸡胚成纤维细胞(CEF)检测重组菌的侵袭率，结果显示NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-TA4侵袭率为0.20%，NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-AMA1pSIP409-FnBPA-pgsA’-TA4-AMA1侵袭率为0.21%，对照菌NC8pSIP409-pgsA’侵袭率为0.02%，NC8pSIP409-FnBPA侵袭率为0.40%，虽然共表达抗原会影响重组菌的侵袭率，但是仍显著高于对照组(P＜0.001，P＜0.01)。
1日龄雏鸡被随机分为五个对照组：生理盐水组(Saline)、攻虫组(Challenge)、NC8pSIP409-pgsA’组(pgsA’)、NC8pSIP409-FnBPA组(FnBPA)、商品化弱毒疫苗组(Viccine)；和四个重组乳酸菌组：NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-TA4组(TA4)、NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-TA4-AMA1组(TA4-AMA1)和混合免疫的NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-TA4+NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-AMA1组(TA4+AMA1)。分别于3、4、5、17、18、19日龄进行口服免疫，免疫剂量为1×109CFU/200μl，30日龄时，除Saline组，其余组每只鸡口服接种1×105个E.tenella孢子化卵囊。
在攻虫前，使用ELISA方法检测血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、特异性IgG的含量，以及肠道灌洗液特异性sIgA水平，MTT法检测脾脏淋巴细胞的增殖情况，同时使用流式细胞术检测攻虫前后外周血淋巴细胞中CD3+CD4+和CD3+CD8+淋巴细胞分化情况和盲肠扁桃体淋巴细胞中B淋巴细胞含量。在攻虫后，统计相对增重率、卵囊排出量、盲肠病变计分等保护指标并分析。
分析动物实验数据，ELISA结果显示单表达抗原组血清中检测到特异性IgG显著高于Saline组和空载体组(P＜0.001，P＜0.01)，TA4-AMA1组与单表达抗原组差异不显著(P＞0.05)；特异性sIgA水平重组乳酸菌组也显著高于Saline和空载体组(P＜0.001，P＜0.01)；血清中细胞因子检测，表明TA4-AMA1组的IFN-γ、IL-2、IL-4含量高于其他实验组，显著高于对照组(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05)。使用纯化后的TA4、AMA1蛋白与脾淋巴细胞共培养，检测淋巴细胞特异性增殖能力，结果可见单表达抗原的TA4和AMA1组淋巴细胞增殖结果显著高于其他组(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05)。免疫重组乳酸菌后，TA4-AMA1组可诱导外周血淋巴细胞中高水平的CD3+CD8+细胞水平，而CD3+CD4+淋巴细胞水平最高为AMA1组。攻虫后，TA4-AMA1和TA4+AMA1组体重增长明显，相对增重率分别为89.64%和84.31%；卵囊减少率最高为Vaccine组，为80.35%，其次为TA4+AMA1组，卵囊减少率为67.50%；剖检发现TA4-AMA1和TA4+AMA1组盲肠病变较轻，病变计分均为0.5，显著低于Challenge组(P＜0.001)和对照组(P＜0.05)。TA4、AMA1、TA4-AMA1、TA4+AMA1组的ACI指数分别为144.83、142.59、174.64和169.31，NC8pSIP409-FnBPA-pgsA’-TA4-AMA1抗球虫效果最佳。
本研究结果表明使用表达FnBPA的侵入型植物乳杆菌作为载体，共表达E.tenella的表面抗原TA4和顶膜抗原AMA1免疫雏鸡，提高机体细胞免疫和体液免疫水平，并能提高雏鸡对球虫的抵抗力，为鸡球虫病的防治提供新的思路。