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[背景]
蜱是最早被确认可将病原体传播给人类的媒介节肢动物，是世界上仅次于蚊子的第二大传染病媒介，可以感染、传播和贮存的病原体包括病毒、细菌和原虫等，且通常会同时携带多种病原体。
病毒是蜱传病原体的重要组成部分。目前，已经从蜱中发现了至少160种病毒，其中25％左右与人类和/或动物的病毒感染性疾病有关，主要以各种硬蜱作为传播媒介。其中，正内罗病毒隶属于布尼亚病毒目、内罗病毒科，是有包膜且基因组不连续(由大、中和小三段单股负链组成)的RNA病毒，其中一些会引起人类和动物严重疾病。Tamdy正内罗病毒至少包括五种不同型别，其在多种蜱中广泛分布，且被报道与人类疾病以及脊椎动物感染有关。此外，还有近年来报道的与蜱咬病人发热疾病有关、属于黄病毒科荆门病毒群的荆门蜱病毒(Jingmen tick virus，JMTV)和Alongshanvirus(ALSV)两种蜱传分节段RNA病毒，以及致病性尚未明确的新发蜱病毒SouthBayVirus(SBV)和Black-leggedtickphlebovirus(BTPV)等。目前，对这些新型蜱传病毒的研究相对较少，因此，有必要对其进行探索和研究。
自1982年以来，我国大陆已经发现了由近30种不同蜱类传播的33种新发蜱传病原体，其中立克次体、无形体、埃立克体、螺旋体、巴贝西虫和泰勒虫等细菌和原虫最为常见，感染后可分别引起人和动物立克次体病、无形体病、埃立克体病、莱姆病、蜱传回归热、巴贝西虫病以及泰勒虫病。此外，一种蜱可以同时携带和传播多种病原体，几种蜱媒疾病往往共存于同一自然疫源地。被复合感染的蜱类叮咬的人和动物的症状会更加复杂，预后更差。因此，新发蜱传病原体的流行及其复合感染将对人类和动物健康构成严重威胁。
宏转录组学具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等优势，同时结合生物信息学工具，可以有效获得病毒的全基因组信息，还可以在保守的宿主基因背景下，无偏倚的量化病毒丰度，为揭示病毒的遗传多样性、挖掘新病毒、以及防控新发传染病等提供重要技术支持。当前，融合病原学(病原体特征及其致病性)、生态学(生态环境、传播媒介和宿主动物)全面、系统的自然疫源地调查研究已成为蜱媒病研究的发展趋势。
我国蜱种丰富，蜱媒传染病的自然疫源地复杂、流行形势严峻，因此需要对其深入调查研究。
[目的]
1.对我国南方地区七个省/直辖市的蜱进行病毒组筛查，获得其携带的病毒谱，识别新病毒。
2.获得新发现的蜱病毒的分离株，进一步研究其遗传特性和生物学特性，评价其对人类的感染性和致病性。
3.了解不同地域、不同蜱种中，成功分离的新的蜱病毒以及其他多种新发蜱传病原体的感染与复合感染情况。
[方法]
1.蜱标本采集、鉴定:在我国不同地区选择有代表性的地理景观作为采样点，于2017～2019年在蜱活跃的高峰季节进行蜱类标本的采集。游离蜱采用拖旗法采集，寄生蜱则通过控制或者捕获家畜或野生动物后采集，之后对其进行形态学鉴定。
2.宏转录组测序、分析:提取蜱标本的RNA并检测其浓度、纯度和完整性，之后构建宏转录组测序文库并测序。使用生物信息学分析软件，对测序产生的数据分别进行病毒基因组的发现和组装以及相对转录本丰度量化等。
3.病毒分离培养、鉴定:将蜱标本分别接种到HUVEC、Vero81和IDE8细胞上进行病毒分离，盲传三代后提取细胞培养物RNA进行高通量测序筛查。待获得病毒分离株后，对其全基因组进行测序，并运用生物信息学分析软件进行进一步的结构和功能预测、同源性分析、系统发育分析和重组分析;建立病毒检测方法和生长复制曲线;采用超薄切片电镜观察病毒的形态特征;通过间接免疫荧光实验和RNA荧光原位杂交实验观察病毒在不同细胞中的感染情况;同时通过间接免疫荧光实验对哨点医院收集的蜱咬病人双份血清标本进行病毒筛查。
4.蜱携带病原体检测:将蜱标本研磨并提取其核酸;使用特异性引物，采用一步法荧光定量RT-PCR对蜱标本中的云南蜱病毒(Yunnan tick virus，YNTV)进行筛查，并通过一步法RT-PCR扩增YNTV的大、中和小三个片段;采用SYBRGreen荧光定量RT-PCR筛查蜱标本中的Tǎchéngtickvirus1(TTV1)、Tamdyvirus(TDYV)、JMTV、ALSV、SBV和BTPV1～3;采用普通/半巢式/巢式PCR对蜱标本中的立克次体、无形体、埃立克体、螺旋体、巴贝西虫和泰勒虫进行检测;在Mega7.0软件中对测序产生的序列进行系统发育分析;采用卡方检验或Fisher确切检验比较不同地点以及不同蜱种中各种病原体的感染情况。
[主要结果]
1.宏转录组测序结果:本研究共构建了93个测序文库，得到3473838929条原始reads，3362776236条高质量reads(clean reads)以及28413469条平均长度为592nt的contigs。其中有22930535条reads可以注释到病毒相关序列，且以未分类病毒为主，其余病毒共分为65个科。
2.云南蜱病毒分离培养、鉴定结果:从云南剑川猛突血蜱幼蜱的HUVEC细胞培养物中分离到一株新的正内罗病毒，将其暂时命名为云南蜱病毒(YNTV)。①YNTV为负链RNA病毒，其基因组共分为大、中和小三个片段，其长度分别为12077nt、4489nt和2057nt，分别编码含有3255、1357和492个氨基酸的大蛋白、糖蛋白前体以及核衣壳蛋白;②仅中片段具有信号肽和跨膜螺旋区，大、中和小片段中分别有6个、9个和1个潜在的糖基化位点，且大片段编码的氨基酸序列中存在Pre-MotifA以及MotifA～E6个保守的motif;③同源性分析显示，YNTV与Tamdy正内罗病毒的核苷酸同源性(41.8％～68.0％)和氨基酸同源性(44.2％～63.2％)均高于其与其他正内罗病毒的核苷酸(29.3％～44.2％)和氨基酸(18.4％～32.2％)同源性，表明YNTV是一种新的Tamdy正内罗病毒型别;④YNTV与正内罗病毒代表株基于三个片段氨基酸全长序列的系统发育分析显示，其在进化上属于Tamdy正内罗病毒，且大片段和小片段均与2012年从我国豪猪血蜱中检测到的Wēnzhōutickvirus(WTV)处于同一进化分支，中片段则与我国西北地区蜱咬发热病人中分离的TTV1QH1亲缘关系更近;⑤重组分析显示，YNTV大、中和小三个片段的全基因序列整体上均与WTV的同源性最高，但其大片段在6750～7000bp以及8000～8250bp的位置与TDYV和Songlingvirus(SGLV)的同源性更高，中片段在2700～3200bp、小片段在625～850bp的位置分别与TTV1和SGLV的同源性更高，表明YNTV分离株的三个片段均存在重组信号;⑥基于YNTV大片段和小片段建立的标准曲线分别为:x(大)=(39.99-y(大))/3.390和x(小)=(38.48-y(小))/3.152，其中y为Ct值，病毒载量为10x;⑦病毒生长复制曲线结果显示，YNTV在IDE8和C6/36两种细胞系中基本没有生长，在Vero81细胞中生长缓慢并在接种后的第144h即达到生长的平台期，但其可以在BHK-21和HUVEC两种细胞中迅速复制并在感染的第168h达到生长的平台期，且YNTV的病毒载量变化趋势在五种受感染细胞的冻融物和培养上清中基本一致;⑧YNTV可引起HUVEC细胞产生致细胞病变效应，表现为细胞皱缩、变圆以及折光度增加，而在受感染的BHK-21和Vero81细胞中则无CPE;⑨YNTV病毒颗粒为有包膜的球体，直径大约80～100nm;⑩间接免疫荧光实验和RNA荧光原位杂交实验结果显示，YNTV能够有效感染HUVEC、BHK-21和Vero81三种细胞;(11)牡丹江林业中心医院93例蜱咬病人的急性期和恢复期双份血清标本YNTV筛查结果为阴性，说明其均未感染YNTV。
3.蜱传病毒检测结果:YNTV的总阳性率为1.34％，仅在广西和云南的卵形硬蜱、爪哇花蜱和猛突血蜱中检出，且蜱标本中测得的YNTV片段与该病毒分离株在进化树上聚集在一起，形成不同于其他Tamdy正内罗病毒的独立分支;JMTV的总阳性率为3.23％，在广西、重庆、贵州和黑龙江4省/直辖市的龟形花蜱、豪猪血蜱、爪哇花蜱、全沟硬蜱和微小扇头蜱中检出;在吉林省的嗜群血蜱中检测到1份BTPV1阳性样本;TTV1、TDYV、ALSV、SBV、BTPV2和BTPV3六种病毒的检测结果均为阴性。
4.蜱传细菌和原虫检测结果:共从8个省/直辖市的14种(豪猪血蜱和镰形扇头蜱除外)356只蜱(阳性率为47.85％)中检测到24种已知病原体(6种立克次体、4种无形体、4种埃立克体、3种螺旋体、3种巴贝西虫和4种泰勒虫)以及17种未定种病原体(4种立克次体、4种无形体、3种埃立克体、2种螺旋体和4种巴贝西虫)。立克次体、无形体、埃立克体、螺旋体、巴贝西虫和泰勒虫的平均感染率分别为33.87％、10.89％、2.15％、4.44％、1.75％和3.23％，且其在不同地点以及不同蜱种中的感染率差异均具有统计学意义。
5.蜱标本中病原体的复合感染情况:采集的16种744只蜱中，共9种76只(10.22％)存在复合感染情况，龟形花蜱中的复合感染发生率最高，其次为嗜龟花蜱和猛突血蜱。有69只蜱同时携带两种病原体，另外7只蜱则同时携带三种病原体，以立克次体和无形体的复合感染最为常见。此外，在猛突血蜱中还存在YNTV与立克次体或/和无形体复合感染的情况，在龟形花蜱、全沟硬蜱和微小扇头蜱中存在JMTV与多种不同细菌/原虫复合感染的情况。
[结论]
1.我国南方地区蜱类携带的病毒种类多样，且以未分类病毒为主。
2.从云南的猛突血蜱中分离到一株新的Tamdy正内罗病毒，将其命名为云南蜱病毒(YNTV)，其基因组结构和功能与典型的正内罗病毒相似，且在其三个片段的全基因序列中均有重组事件的发生。
3.YNTV具有正内罗病毒的典型形态特征;可以感染多种哺乳动物细胞系并在其中生长复制，且引起HUVEC细胞产生CPE，提示其具有潜在致病性。
4.YNTV主要在我国云南和广西的蜱类中分布，卵形硬蜱、爪哇花蜱和猛突血蜱为其可能的传播媒介，且其可以与立克次体和无形体发生复合感染。
5.我国蜱类中存在多种病毒、细菌和原虫的感染与复合感染，此外，还有一些潜在的新病原，反映了我国蜱类携带病原体的高度多样性和复杂性。
[创新点]
1.本研究从云南的猛突血蜱中分离到一株新的正内罗病毒，在未发现其可以感染人之前即对其相关特性进行了初步研究，为后续评价其致病性等奠定了基础。
2.本研究对我国南方约一半省/直辖市地区内近10种蜱携带的病毒组进行了全面调查，为后续蜱传病毒的深入研究及蜱媒病毒性疾病的防控提供理论依据。
3.本研究对我国3种不同动物地理区划内近20种蜱携带的9种新发蜱传病毒以及6种新发蜱传细菌和原虫的感染与复合感染情况进行了广泛筛查，为了解蜱媒传染病风险地域及制定相应精准防控策略和措施提供科学依据。
蜱是最早被确认可将病原体传播给人类的媒介节肢动物，是世界上仅次于蚊子的第二大传染病媒介，可以感染、传播和贮存的病原体包括病毒、细菌和原虫等，且通常会同时携带多种病原体。
病毒是蜱传病原体的重要组成部分。目前，已经从蜱中发现了至少160种病毒，其中25％左右与人类和/或动物的病毒感染性疾病有关，主要以各种硬蜱作为传播媒介。其中，正内罗病毒隶属于布尼亚病毒目、内罗病毒科，是有包膜且基因组不连续(由大、中和小三段单股负链组成)的RNA病毒，其中一些会引起人类和动物严重疾病。Tamdy正内罗病毒至少包括五种不同型别，其在多种蜱中广泛分布，且被报道与人类疾病以及脊椎动物感染有关。此外，还有近年来报道的与蜱咬病人发热疾病有关、属于黄病毒科荆门病毒群的荆门蜱病毒(Jingmen tick virus，JMTV)和Alongshanvirus(ALSV)两种蜱传分节段RNA病毒，以及致病性尚未明确的新发蜱病毒SouthBayVirus(SBV)和Black-leggedtickphlebovirus(BTPV)等。目前，对这些新型蜱传病毒的研究相对较少，因此，有必要对其进行探索和研究。
自1982年以来，我国大陆已经发现了由近30种不同蜱类传播的33种新发蜱传病原体，其中立克次体、无形体、埃立克体、螺旋体、巴贝西虫和泰勒虫等细菌和原虫最为常见，感染后可分别引起人和动物立克次体病、无形体病、埃立克体病、莱姆病、蜱传回归热、巴贝西虫病以及泰勒虫病。此外，一种蜱可以同时携带和传播多种病原体，几种蜱媒疾病往往共存于同一自然疫源地。被复合感染的蜱类叮咬的人和动物的症状会更加复杂，预后更差。因此，新发蜱传病原体的流行及其复合感染将对人类和动物健康构成严重威胁。
宏转录组学具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等优势，同时结合生物信息学工具，可以有效获得病毒的全基因组信息，还可以在保守的宿主基因背景下，无偏倚的量化病毒丰度，为揭示病毒的遗传多样性、挖掘新病毒、以及防控新发传染病等提供重要技术支持。当前，融合病原学(病原体特征及其致病性)、生态学(生态环境、传播媒介和宿主动物)全面、系统的自然疫源地调查研究已成为蜱媒病研究的发展趋势。
我国蜱种丰富，蜱媒传染病的自然疫源地复杂、流行形势严峻，因此需要对其深入调查研究。
[目的]
1.对我国南方地区七个省/直辖市的蜱进行病毒组筛查，获得其携带的病毒谱，识别新病毒。
2.获得新发现的蜱病毒的分离株，进一步研究其遗传特性和生物学特性，评价其对人类的感染性和致病性。
3.了解不同地域、不同蜱种中，成功分离的新的蜱病毒以及其他多种新发蜱传病原体的感染与复合感染情况。
[方法]
1.蜱标本采集、鉴定:在我国不同地区选择有代表性的地理景观作为采样点，于2017～2019年在蜱活跃的高峰季节进行蜱类标本的采集。游离蜱采用拖旗法采集，寄生蜱则通过控制或者捕获家畜或野生动物后采集，之后对其进行形态学鉴定。
2.宏转录组测序、分析:提取蜱标本的RNA并检测其浓度、纯度和完整性，之后构建宏转录组测序文库并测序。使用生物信息学分析软件，对测序产生的数据分别进行病毒基因组的发现和组装以及相对转录本丰度量化等。
3.病毒分离培养、鉴定:将蜱标本分别接种到HUVEC、Vero81和IDE8细胞上进行病毒分离，盲传三代后提取细胞培养物RNA进行高通量测序筛查。待获得病毒分离株后，对其全基因组进行测序，并运用生物信息学分析软件进行进一步的结构和功能预测、同源性分析、系统发育分析和重组分析;建立病毒检测方法和生长复制曲线;采用超薄切片电镜观察病毒的形态特征;通过间接免疫荧光实验和RNA荧光原位杂交实验观察病毒在不同细胞中的感染情况;同时通过间接免疫荧光实验对哨点医院收集的蜱咬病人双份血清标本进行病毒筛查。
4.蜱携带病原体检测:将蜱标本研磨并提取其核酸;使用特异性引物，采用一步法荧光定量RT-PCR对蜱标本中的云南蜱病毒(Yunnan tick virus，YNTV)进行筛查，并通过一步法RT-PCR扩增YNTV的大、中和小三个片段;采用SYBRGreen荧光定量RT-PCR筛查蜱标本中的Tǎchéngtickvirus1(TTV1)、Tamdyvirus(TDYV)、JMTV、ALSV、SBV和BTPV1～3;采用普通/半巢式/巢式PCR对蜱标本中的立克次体、无形体、埃立克体、螺旋体、巴贝西虫和泰勒虫进行检测;在Mega7.0软件中对测序产生的序列进行系统发育分析;采用卡方检验或Fisher确切检验比较不同地点以及不同蜱种中各种病原体的感染情况。
[主要结果]
1.宏转录组测序结果:本研究共构建了93个测序文库，得到3473838929条原始reads，3362776236条高质量reads(clean reads)以及28413469条平均长度为592nt的contigs。其中有22930535条reads可以注释到病毒相关序列，且以未分类病毒为主，其余病毒共分为65个科。
2.云南蜱病毒分离培养、鉴定结果:从云南剑川猛突血蜱幼蜱的HUVEC细胞培养物中分离到一株新的正内罗病毒，将其暂时命名为云南蜱病毒(YNTV)。①YNTV为负链RNA病毒，其基因组共分为大、中和小三个片段，其长度分别为12077nt、4489nt和2057nt，分别编码含有3255、1357和492个氨基酸的大蛋白、糖蛋白前体以及核衣壳蛋白;②仅中片段具有信号肽和跨膜螺旋区，大、中和小片段中分别有6个、9个和1个潜在的糖基化位点，且大片段编码的氨基酸序列中存在Pre-MotifA以及MotifA～E6个保守的motif;③同源性分析显示，YNTV与Tamdy正内罗病毒的核苷酸同源性(41.8％～68.0％)和氨基酸同源性(44.2％～63.2％)均高于其与其他正内罗病毒的核苷酸(29.3％～44.2％)和氨基酸(18.4％～32.2％)同源性，表明YNTV是一种新的Tamdy正内罗病毒型别;④YNTV与正内罗病毒代表株基于三个片段氨基酸全长序列的系统发育分析显示，其在进化上属于Tamdy正内罗病毒，且大片段和小片段均与2012年从我国豪猪血蜱中检测到的Wēnzhōutickvirus(WTV)处于同一进化分支，中片段则与我国西北地区蜱咬发热病人中分离的TTV1QH1亲缘关系更近;⑤重组分析显示，YNTV大、中和小三个片段的全基因序列整体上均与WTV的同源性最高，但其大片段在6750～7000bp以及8000～8250bp的位置与TDYV和Songlingvirus(SGLV)的同源性更高，中片段在2700～3200bp、小片段在625～850bp的位置分别与TTV1和SGLV的同源性更高，表明YNTV分离株的三个片段均存在重组信号;⑥基于YNTV大片段和小片段建立的标准曲线分别为:x(大)=(39.99-y(大))/3.390和x(小)=(38.48-y(小))/3.152，其中y为Ct值，病毒载量为10x;⑦病毒生长复制曲线结果显示，YNTV在IDE8和C6/36两种细胞系中基本没有生长，在Vero81细胞中生长缓慢并在接种后的第144h即达到生长的平台期，但其可以在BHK-21和HUVEC两种细胞中迅速复制并在感染的第168h达到生长的平台期，且YNTV的病毒载量变化趋势在五种受感染细胞的冻融物和培养上清中基本一致;⑧YNTV可引起HUVEC细胞产生致细胞病变效应，表现为细胞皱缩、变圆以及折光度增加，而在受感染的BHK-21和Vero81细胞中则无CPE;⑨YNTV病毒颗粒为有包膜的球体，直径大约80～100nm;⑩间接免疫荧光实验和RNA荧光原位杂交实验结果显示，YNTV能够有效感染HUVEC、BHK-21和Vero81三种细胞;(11)牡丹江林业中心医院93例蜱咬病人的急性期和恢复期双份血清标本YNTV筛查结果为阴性，说明其均未感染YNTV。
3.蜱传病毒检测结果:YNTV的总阳性率为1.34％，仅在广西和云南的卵形硬蜱、爪哇花蜱和猛突血蜱中检出，且蜱标本中测得的YNTV片段与该病毒分离株在进化树上聚集在一起，形成不同于其他Tamdy正内罗病毒的独立分支;JMTV的总阳性率为3.23％，在广西、重庆、贵州和黑龙江4省/直辖市的龟形花蜱、豪猪血蜱、爪哇花蜱、全沟硬蜱和微小扇头蜱中检出;在吉林省的嗜群血蜱中检测到1份BTPV1阳性样本;TTV1、TDYV、ALSV、SBV、BTPV2和BTPV3六种病毒的检测结果均为阴性。
4.蜱传细菌和原虫检测结果:共从8个省/直辖市的14种(豪猪血蜱和镰形扇头蜱除外)356只蜱(阳性率为47.85％)中检测到24种已知病原体(6种立克次体、4种无形体、4种埃立克体、3种螺旋体、3种巴贝西虫和4种泰勒虫)以及17种未定种病原体(4种立克次体、4种无形体、3种埃立克体、2种螺旋体和4种巴贝西虫)。立克次体、无形体、埃立克体、螺旋体、巴贝西虫和泰勒虫的平均感染率分别为33.87％、10.89％、2.15％、4.44％、1.75％和3.23％，且其在不同地点以及不同蜱种中的感染率差异均具有统计学意义。
5.蜱标本中病原体的复合感染情况:采集的16种744只蜱中，共9种76只(10.22％)存在复合感染情况，龟形花蜱中的复合感染发生率最高，其次为嗜龟花蜱和猛突血蜱。有69只蜱同时携带两种病原体，另外7只蜱则同时携带三种病原体，以立克次体和无形体的复合感染最为常见。此外，在猛突血蜱中还存在YNTV与立克次体或/和无形体复合感染的情况，在龟形花蜱、全沟硬蜱和微小扇头蜱中存在JMTV与多种不同细菌/原虫复合感染的情况。
[结论]
1.我国南方地区蜱类携带的病毒种类多样，且以未分类病毒为主。
2.从云南的猛突血蜱中分离到一株新的Tamdy正内罗病毒，将其命名为云南蜱病毒(YNTV)，其基因组结构和功能与典型的正内罗病毒相似，且在其三个片段的全基因序列中均有重组事件的发生。
3.YNTV具有正内罗病毒的典型形态特征;可以感染多种哺乳动物细胞系并在其中生长复制，且引起HUVEC细胞产生CPE，提示其具有潜在致病性。
4.YNTV主要在我国云南和广西的蜱类中分布，卵形硬蜱、爪哇花蜱和猛突血蜱为其可能的传播媒介，且其可以与立克次体和无形体发生复合感染。
5.我国蜱类中存在多种病毒、细菌和原虫的感染与复合感染，此外，还有一些潜在的新病原，反映了我国蜱类携带病原体的高度多样性和复杂性。
[创新点]
1.本研究从云南的猛突血蜱中分离到一株新的正内罗病毒，在未发现其可以感染人之前即对其相关特性进行了初步研究，为后续评价其致病性等奠定了基础。
2.本研究对我国南方约一半省/直辖市地区内近10种蜱携带的病毒组进行了全面调查，为后续蜱传病毒的深入研究及蜱媒病毒性疾病的防控提供理论依据。
3.本研究对我国3种不同动物地理区划内近20种蜱携带的9种新发蜱传病毒以及6种新发蜱传细菌和原虫的感染与复合感染情况进行了广泛筛查，为了解蜱媒传染病风险地域及制定相应精准防控策略和措施提供科学依据。