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植物在干旱、高盐、高温、低温等逆境胁迫下,体内会产生各种活性氧分子(Reactive Oxygen Species,ROS),如:超氧离子、单离子氧、H202和OH等。ROS在体内积累,将使膜脂发生过氧化作用或脱脂形成丙二醛(malondialdehyde,MDA),膜系统受到破坏。谷胱甘肽(Glutathione,GSH)通过谷胱甘肽-抗坏血酸还原系统清除ROS,是植物体内抗氧化耐旱机制之一。GSH的生物合成经历两个ATP参与的反应步骤:L谷氨酸和L-半胱氨酸在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(y-GCS or:GSHⅠ,EC6.3.2.2)的催化下生成γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-GC),随后在谷胱甘肽合成酶(GC or:GSHⅡ,EC6.3.2.3)的催化下,γ-GC与甘氨酸缩合形成GSH。GSHⅠ、GSHⅡ、ATP酶编码基因调控着植物体内GSH的合成,因而调控着植物体内GSH抗氧化耐旱性。本论文从分离的酿酒酵母菌株ScHL5(暂定名)中克隆上述谷胱甘肽合成酶系基因,以限速酶基因gshⅠ,构建gshⅠ原核表达载体;构建gshⅠ植物表达载体:通过农杆菌介导,用改进的Dip法(韩红岩等,2003)转化拟南芥;以Southern blotting等分子杂交技术检测筛选获得转gshⅠ基因拟南芥植株;对转基因植株进行耐旱生理测试;通过测定不同培养条件下线粒体ATP酶活性、ATP含量和GSH含量,探讨线粒体ATP酶活性对GSH生物合成的影响。本研究的主要结果如下:1、克隆获得gshⅠ和gshⅡ基因并在GenBank注册在Lisowsky(1993)和Yoshiharu(1998)研究的基础上,设计特异性引物,从酿酒酵母基因组中克隆催化GSH生物合成的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHⅠ)和谷胱甘肽合成酶(GSHⅡ)基因的开放阅读框序列,与前人的序列同源性分别达到98%和99%,证明该基因序列克隆正确。拷贝数分析表明gshⅠ以单拷贝形式存在。该基因已在GenBank注册,注册号分别是:EF633694和EF633695。2、gshⅠ基因转化的大肠杆菌表达特异蛋白将GSH合成的限速酶gshⅠ基因构建到原核表达载体pRSET-B上,经酶切分析并测序验证,该基因开放阅读框插入位点正确。将重组质粒转入大肠杆菌工程菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达了约81kDa的融合蛋白,分子量与DNAStar分析结果一致。证明gshⅠ基因在大肠杆菌中有表达功能,表达量随着时间延长而增加:pRSET-B是gshⅠ基因适合的原核表达载体。3、gshⅠ基因转化拟南芥获得转基因植株Izawa等(1995)的研究表明GSH I活性大小与GSH生物合成直接相关。将gshⅠ构建到植物表达载体pBI121上,经PCR、酶切分析并测序验证,gshⅠ基因序列插入位点正确。通过农杆菌EHAl05介导转化拟南芥,转基因植株经过Southern、PCR-Southern和Northern分子杂交分析表明,已获得gshⅠ基因整合到拟南芥基因组中且有表达的转基因植株。4、转gshⅠ基因拟南芥植株干旱胁迫下的MDA和电导率增幅比对照缓慢,其他生理指标与对照差异不明显转基因拟南芥植株耐旱性生理测试的结果表明,转gshⅠ基因植株中GSH含量增加;在干旱胁迫下,转基因植株和对照的GSH含量都有所增加,但转基因植株增加更多。这表明干旱诱导了对照和转基因植株GSH的合成,gshⅠ基因提高了转基因植株合成GSH的水平。转基因植株中谷胱甘肽还原酶(GR)活性要比对照的高得多,提高了GSH/GSSG比率,使氧化态GSH得到还原,表明干旱也启动了GSH的再生系统。转基因植株叶片相对含水量变化不明显(与对照相比),但是MDA含量和相对电导率(反映质膜透性)增加幅度均低于对照植株,表明转基因植株提高了膜系统的稳定性(抗氧化作用);干旱胁迫下,对照和转基因植株SOD和CAT活性均下降,但没有明显差异,表明GSH与SOD、CAT对活性氧的清除机制不同。5、酵母线粒体ATP酶活性对谷胱甘肽合成有影响GSH的生物合成需要ATP的参与,但ATP酶活性与谷胱甘肽合成关系尚未见报道。本文通过改变酵母细胞的培养温度、时间和pH,测定ATP酶的活性、ATP含量和GSH含量。结果分析表明,在酵母细胞中,GSH含量与ATP酶的活性紧密相关。酵母在培养温度30~C、培养时间60h、pH6.0时,胞内GSH产量最高,此时线粒体ATP酶活性高达21.922μmol/mg.protein.h,胞内ATP累积量最大,达14.755nmol/g.DW。