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背景:肾缺血再灌注损伤广泛存在于临床实践的各个领域,从栓塞或血栓性事件、循环性休克和低血压到外科手术如心脏旁路手术、与器官获取相关的强制性肾损伤以及一系列其他肾脏损害。这种损伤导致肾功能迅速下降,增加了患者终末期肾病的发病率和死亡率。患者短期和长期预后取决于损伤的可逆性和后续恢复情况。肾脏对缺血-再灌注损伤(Ichemia-reperfusion injury,IRI)非常敏感,氧供应和需求的不匹配引起肾脏氧化代谢的减少,进而会导致管状上皮细胞的损伤和死亡。肾小管上皮细胞凋亡是肾IRI的一个中心特征,伴随细胞膜电位的迅速丧失,从而导致急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)。越来越多的研究表明,线粒体是参与肾脏细胞凋亡信号的汇聚点。此外,线粒体损伤已被报道为导致肾I/R损伤的主要机制,BCL-2家族被认为是肾I/R损伤线粒体途径的主要调控因子。Caspase蛋白家族中caspase-3一直被当做调控肾小管上皮细胞凋亡的重要调控点,也是缺血再灌注损伤保护性治疗的重要作用靶点。众多学者认为通过各种途径降低Caspase-3的活化水平,是保护肾脏缺血再灌注后肾功能的有效手段之一。线粒体凋亡途径则是肾小管上皮细胞凋亡的重要途径之一,Bax/Bcl-2的比值达到一种平衡状态是决定肾小管上皮细胞的凋亡重要指标。PI3K/AKT信号通路激活是肾脏I/R损伤中的重要保护机制,其主要通过调控下游靶蛋白(如血红素氧合酶(HO)-1、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、转录因子NF-E2相关因子)等调控细胞凋亡、炎症反应及氧化应激等病理损伤过程。有关学者研究发现,相关受体介导的PI3K/AKT激活能够有效减轻I/R诱导的肾小管上皮细胞凋亡与氧化应激反应,且其肾脏保护功能可以被PI3K/AKT抑制剂显著逆转。这表明,选择性干预PI3K/AKT途径可能成为防治肾脏缺血再灌注损伤的有效靶点。芹黄素是自然界中常见的抗氧化剂抗脂质过氧化的天然黄酮类物质,广泛存在于水果及植物中(多种水果、蔬菜、豆类和茶叶,玄参科植物水蔓青,蓼科虎杖,百合科毛叶藜芦,洋甘菊中含量较高),它具有清除自由基、抗氧化、抗突变、抗肿瘤(大量实验已证实芹黄素对前列腺癌、大肠癌、卵巢癌、神经系统肿瘤、乳腺癌均有一定的抑制作用)抗凋亡和调节免疫、防治血管硬化、降血糖等作用。芹黄素抗炎作用的机制可能是通过抑制COX-2活性从而减少促炎性细胞因子的产生而达到抗炎效果。与其他黄酮类物质(槲皮素、杨梅酮)相比具有低毒、无诱变性等特点。文献报告芹黄素对心肌、大脑及肝脏缺血再灌注损伤、药物性肝肾损害有一定保护作用,而对肾脏缺血性损伤尚未见报道,本实验证实芹黄素通过调解肾小管上皮细胞凋亡来对大鼠肾脏缺血再灌注损伤有一定的保护作用。目的:采用大鼠肾动脉缺血再灌注损伤导致急性肾损伤动物模型,检验芹黄素对大鼠肾缺血再灌注损伤是否具有保护作用,并初步探讨了芹黄素能通过减轻肾小管上皮细胞的凋亡来降低肾损伤;通过培养HK-2细胞,建立缺氧/复氧模型进一步证实芹黄素对肾小管上皮细胞的保护作用,并进一步探讨了其中可能的生物学机制,为芹黄素药物治疗肾脏缺血灌注损伤提供一定的理论依据。方法:动物实验部分:动物分组18只雄性SD大鼠(重180±10g)随机分3组:假手术组(sham组),缺血再灌注组(IR组),芹黄素预处理+缺血再灌注组(IR+API组)。其中sham组仅予术前1小时生理盐水腹腔注射,IR组不给药,IR+API组术前1小时腹腔注射芹黄素(20mg/kg)。采用肾蒂夹闭法制造肾缺血再灌注模型,采用强生公司生化自动分析仪检测各组肾功能(肌酐、尿素氮)变化;通过切片PAS染色观察IR组及芹黄素处理后肾脏组织病理形态变化及损伤评分;采用Tunel方法观察各组肾小管上皮细胞凋亡情况。细胞实验部分:选取处于对数生长期的肾小管上皮细胞(HK-2),2*105个/孔的密度接种于6孔板中。待接种20小时后,将细胞培养基替换成含1%胎牛血清的DMEM培养基培养24小时,以达到细胞相对同步化的目的,按文献所给方法建立缺氧/复氧(H/R)模型。分组:对照组:细胞在正常环境中培养,缺氧复氧(H/R)组;按模型建立方法处理;芹黄素(H/R+API)组:模型建立前2h加入芹黄素浓度20um/l,进入缺氧/复氧模型。CCK-8试剂盒检测各组HK-2细胞的活力,观察芹黄素对HK-2细胞活力的影响;采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况及芹黄素对肾小管上皮细胞凋亡的保护作用,进一步分析相关凋亡蛋白(caspase-3、BCL-2、Bax)变化,初步探索可能的信号传导通路PI3K/AKt蛋白的变化。结果:建立大鼠肾缺血再灌注模型,术后24小时,强生公司生化自动分析仪检测大鼠肾功能变化,检测指标为Scr和BUN。IR组血肌酐为79.8±8.6umol/l,尿素氮23.8±3.7mmol/l,IR+API组血肌酐为39.5±6.4umol/l,尿素氮12.6±1.2mmol/l。IR+API组的肌酐及尿素氮水平均有显著下降,且有统计学意义。说明芹黄素可保护大鼠缺血再灌注后肾脏损伤功能;缺血再灌注后各组大鼠肾大体标本均有充血水肿,行切片PAS染色观察其病理损伤情况,IR组见明显组织损伤,以皮质和髓质交界区最重,主要病理改变为间质出血、水肿,炎症细胞浸润,小管肿胀,肾小管上皮细胞形态异常,刷状缘紊乱消失,管腔内见脱落小管皮细胞,可见多种管型如蛋白管型,颗粒管型,红细胞管型。IR+API组的病理损伤较IR组有所减轻:间质出血减少,水肿减轻,浸润炎症细胞减少,各种管型变少,异常形态有改善。说明芹黄素可减轻大鼠肾脏缺血再灌注后的损伤,保护肾功能。将IR组肾小管上皮细胞凋亡阳性细胞数与IR+API组阳性细胞数量相比较,IR+API组凋亡细胞数明显减少。说明芹黄素治疗可抑制缺血再灌注损伤后小管上皮细凋亡减轻肾小管损伤。CCK-8实验提示H/R组细胞存活率为0.61±0.06,H/R+API组为0.85±0.05,结果表明提示芹黄素能保护HK-2细胞活性;采用流式细胞仪AnnexinⅣ/PI法分别检测HK-2细胞control、H/R组及H/R+API组凋亡率,H/R组凋亡率达40.19%,而H/R+API组凋亡率降到20.98%,说明API能有效地抑制HK-2细胞凋亡。HK-2细胞缺氧/复氧后,H/R组caspase-3活性较control组明显升高,且caspase-3蛋白表达显著升高,予以API干预后,Caspase-3活性较H/R组明显降低,且Caspase-3蛋白的表达有所下降;检测bax、Bcl-2、PI3K、p-AKt及AKT蛋白表达水平。H/R损伤后,促凋亡蛋白Bax表达增加,抑制凋亡蛋白Bcl-2表达减少,磷酸化PI3K蛋白表达明显减少及p-AKT减少。予以芹黄素干预后,API组可见Bax蛋白较H/R组有所下降,Bcl-2蛋白及磷酸化PI3K蛋白、p-AKt蛋白表达有所增加。结论:本实验证实芹黄素通过减少肾小管上皮细胞的凋亡对肾脏缺血再灌注损伤有一定保护作用;抗凋亡作用主要通过线粒体途径调节Bcl-2家族蛋白的表达及活化来实现;PI3K/AKT信号通路的激活在芹黄素对HK-2细胞缺氧/复氧损伤保护作用中发挥一定作用;它对其他凋亡相关基因是否也有作用及相关机制,仍需要更全面、更深入的研究。