论文部分内容阅读
研究背景:慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是临床上常见的血液系统恶性肿瘤。酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor,TKI)作为一线CML治疗已经取得了显著的疗效,但是仍然有30%左右的患者因Bcr-Abl基因突变或Bcr-Abl不依赖途径出现耐药。近年来研究表明,有多种途径能使Bcr-Abl蛋白降解或抑制Bcr-Abl基因表达,而这些途径可能是治疗基因突变或耐药CML的新方法。已有研究证明,诱导自噬性死亡是CML治疗的新策略。我们前期研究结果显示携带自噬基因Beclin-1的溶瘤病毒感染CML,能通过诱导自噬性死亡显著增加溶瘤病毒对CML细胞的杀伤作用,但其能否杀伤CML耐药细胞和白血病干细胞及其分子机制有待进一步阐明。本课题通过二部分分别进行阐述,第一部分应用生物信息学分析,结合使用多种Beclin-1基因突变体,通过GST-Pull down、免疫共沉淀和Western blot等技术研究了 Becl in-1和Bcr-Abl的体外相互作用以及两种蛋白在细胞体内的相互作用;并观察了 K562细胞中Beclin-1过表达对Bcr-Abl启动子活性的影响,为进一步探索Beclin-1过表达诱导自噬性死亡对CML细胞的杀伤作用及下调Bcr-Abl的机制研究奠定了基础。第二部分通过慢病毒载体进一步研究在CML细胞和从CML急性变患者骨髓中分离出的CD34+CD38-细胞中过表达Beclin-1后,观察细胞生长、自噬相关基因的变化,以及Beclin-1过表达对Bcr-Abl的调控作用;应用自噬调控剂和ATG7、UVRAG基因siRNA研究了其对Bcr-Abl下调的影响;探讨了 Beclin-1过表达对Bcr-Abl与p62/SQSMT1共定位的影响。另外,在Bcr-Ab1 T315I突变的耐药细胞株——32D-p210-T315I细胞中过表达Beclin-1,观察细胞生长和自噬相关基因的变化,以及对Bcr-Abl的调控作用。第一部分 自噬基因Beclin-1与慢性粒细胞白血病Bcr-Abl融合基因相互作用的研究目的:分析和研究自噬基因Beclin-1和Bcr-Abl融合基因的相互作用。方法:采用生物信息学方法分析两种基因是否存在直接或间接的相互作用;通过GST-Pull down实验和免疫共沉淀、Western blot等技术研究了 Beclin-1和Bcr-Abl的体外和在细胞体内的相互作用;后续进一步通过双荧光素酶活性试验明确Becl in-1过表达在K562细胞中对Bcr-Abl启动子活性的影响。结果:1.根据生物信息学的预测结果,我们可以看到Beclin-1和抗凋亡蛋白Bcl-2具有直接的相互作用。在中可信度情况下,Beclin-1可能通过Bcl-2与Bcr-Abl具有相互作用。2.GST-Pull down实验发现Beclin-1的C端450-300和450-250氨基酸缺失影响了 Beclin-1与GST或GST-Bcr-Abl的结合,提示Beclin-1和Bcr-Abl的相互作用的结构位于C末端150个氨基酸的区域内。3.免疫共沉淀实验结果表明Beclin-1的C端150氨基酸缺失蛋白(Beclin-1△C150)不能沉淀Bcr-Abl蛋白,而C端100氨基酸缺失蛋白(Beclin-1△C100)能沉淀Bcr-Abl蛋白,进一步证实Beclin-1蛋白与Bcr-Abl融合蛋白相互作用的位置处于C端100-150氨基酸残基内。4.双荧光素酶活性试验发现,共转染Beclin-1-K562细胞中双荧光素酶活性明显降低,表明Beclin-1过表达能显著抑制Bcr-Abl启动子的活性。结论:尽管通过STRING数据库进行生物信息学分析显示,并没有现有数据提示自噬基因Beclin-1与白血病融合基因Bcr-Abl有直接的相互作用关系,但是本研究通过GST-Pull down实验和免疫共沉淀实验证实Beclin-1和Bcr-Abl可能有直接的相互作用关系,其C端100-150氨基酸残基内可能是与Bcr-Abl的结合区域。双荧光素酶活检检测实验显示Beclin-1在K562细胞中过表达抑制Bcr-Abl的转录活性。本研究结果与以往文献中的研究均提示自噬和自噬基因Beclin-1与CML有密切关系,靶向自噬途径可能是治疗CML的新策略。第二部分 Beclin-1过表达诱导CML细胞自噬性死亡及其分子机制研究目的:分析和研究自噬基因Beclin-1过表达对CML细胞自噬的分子机制。方法:1.在K562细胞中用慢病毒过表达Beclin-1,检测其对Bcr-Abl蛋白表达的影响,以及明确是否涉及自噬通路。2.应用扫描电镜和蛋白印迹实验,研究自噬抑制剂3-MA和蛋白酶体抑制剂epoxomicin(Epo)在Beclin-1过表达后对自噬产生的影响。3.应用自噬调控剂和ATG7、UVRAG基因siRNA研究其对Bcr-Abl蛋白调控的影响。4.通过Western blot方法,探讨了 Beclin-1过表达对Bcr-Abl与p62/SQSMT1共定位的影响。5.应用MTT法检测Beclin-1过表达,分别联合3-MA或Epo对K562细胞生长的调节作用。6.在32D-p210-T315I细胞及T315I突变阳性CML患者原代细胞中过表达Beclin-1后,通过MTT、集落培养及Western blot等方法,探讨过表达Beclin-1是否诱导耐药细胞自噬并对生长及集落形成的影响,以及对Bcr-Abl蛋白的调控作用。7.从CML急性变患者骨髓中分离出CD34+CD38-的细胞,应用集落培养法及蛋白印迹法明确Beclin-1过表达对CML干细胞的影响。结果:1.在K562细胞中,Beclin-1过表达并不激活凋亡通路Caspase-3和PAPR。应用Caspase抑制剂未能逆转Beclin-1过表达对Bcr-Abl的抑制作用,说明Beclin-1过表达导致的Bcr-Abl下调与细胞凋亡和Caspase信号通路无关。2.自噬抑制剂3-MA能逆转Beclin-1诱导的自噬;蛋白酶体抑制剂Epo则显著增加Beclin-1过表达诱导自噬。但是,无论是3-MA或是Epo对Beclin-1过表达导致的Bcr-Abl蛋白下调均无明显影响。Western blot实验还显示K562细胞过表达Beclin-1会导致自噬相关基因ATG7和UVRAG表达的上调。3.通过对自噬基因ATG7和UVRAG的siRNA筛选,显示ATG7和UVRAG的干扰均能明显逆转Beclin-1过表达诱导的细胞自噬,表现为LC3-II表达抑制;同时,两种基因的干扰也能部分逆转Bcr-Abl蛋白的下调。4.我们的实验结果显示Beclin-1过表达时,Bcr-Ab1在K562细胞内与p62/SQSTM的共定位增加;应用Cathesin B抑制剂CA074时,与对照组相比,细胞核周围Bcr-Abl与p62/SQSTM的共定位减少;提示Bcr-Abl的降解可能与p62/SQSTM使得Bcr-Abl定位到自溶酶体,随后在蛋白酶Cathesin B作用下导致蛋白降解有关。5.通过Beclin-1过表达或分别联合自噬抑制剂3-MA、蛋白酶体抑制剂Epo对K562细胞生长抑制作用的观察,发现Beclin-1过表达对CML细胞有生长抑制作用。Epo促进自噬联合Beclin-1过表达诱导自噬能显著抑制CML细胞生长。6.在32D-p210-T315I细胞株中过表达Beclin-1后,通过MTT发现过表达Beclin-I后细胞生长受抑。集落培养法检测发现,在T315I突变CML原代细胞过表达Beclin-1后,集落生成减少。通过Western blot方法检测,自噬相关基因LC3II表达增加,诱导自噬发生,同时p-Bcr-Abl蛋白表达水平下降。7.应用集落培养法检测Beclin-1过表达对CFU-GM集落的影响,结果显示Beclin-1过表达的CD34+CD38-细胞组中,CFU-GM集落数显著降低,提示Beclin-1抑制CML干细胞的粒系集落形成。我们应用Western blot分析了 Beclin-1过表达对CD34+CD38-细胞Bcr-Abl及其信号通路蛋白的影响。显示,Beclin-1过表达时ATG7和UVRAG上调、Bcr-Abl蛋白表达明显受到抑制;另一方面,LC3-II显著增加,P62表达减少,提示CML干细胞发生自噬。结论:我们的研究证明CML敏感株K562过表达Beclin-1能抑制Bcr-Abl的表达,其机制可能与Beclin-1过表达导致ATG7上调、Bcr-Abl与p62/SQSTM的共定位增加从而使得Bcr-Abl蛋白降解有关。Beclin-1过表达能抑制耐药细胞32D-p210-T315I的生长,诱导自噬的发生,同时对Bcr-Abl蛋白降解也有一定的作用,提示T315I突变的细胞中过表达Beclin-1可能通过诱导自噬性死亡达到克服耐药的作用。Beclin-1过表达也能抑制CD34+CD38-细胞体外CFU-GM集落形成,提示诱导自噬性死亡可能是治疗CML、清除Bcr-Abl的CML白血病干细胞的一种新方法。Beclin-1过表达导致Bcr-Abl的下调与自噬依赖的Bcr-Abl蛋白降解有关。在CML白血病干细胞中尚需进行更进一步的深入研究。