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牙骨质是牙根表面的一类薄层矿化组织,可以起到保护根牙本质和牙髓组织,隔绝外界刺激的屏障作用。牙骨质可与牙周膜纤维协同作用,将牙固定在牙槽窝内。正畸的牙移动过程中伴随着牙槽骨和牙骨质的改建。正畸诱导的炎症性牙根吸收是正畸较常见的并发症之一,以牙骨质结构破坏及修复异常为主要特征,严重时可致牙脱落。正畸牙根吸收和牙周炎中牙周组织破坏的过程均存在牙骨质吸收的病理反应,且两者的炎症反应之间有一些共同的分子机制,对这些共同分子机制的深入研究对于改善正畸矫治中的牙周状态、贯彻正畸的健康矫治理念以及牙周炎的治疗都有重要意义。文献表明,白细胞介素-1β（IL-1β）是炎症状态下的牙周组织中含量升高最为显著的炎症相关细胞因子之一。据此我们推测IL-1β在炎症状态下牙周组织的牙骨质吸收中可能发挥作用。MiRNA（microRNA）是一类小分子的非编码RNA片段,因其在真核生物生命活动中的广泛调节作用,近年来已成为基因表达研究关注的热点。细胞内核基因组转录出的miRNA前体经过剪切、加工,成为成熟的miRNA分子,其序列可与靶基因mRNA的3’端非编码区结合,以抑制基因的表达或翻译作用。本课题研究主要包括以下三个部分:（一）、探究IL-1β对成牙骨质细胞的作用。（二）、研究IL-1β与成牙骨质细胞中部分炎症因子相关联的信号通路。（三）、探究miR-146a-5p在成牙骨质细胞炎症反应中的含量变化,并明确其影响。第一部分:IL-1β在成牙骨质细胞中的作用目的:探究不同浓度IL-1β作用不同时间对成牙骨质细胞的影响实验一:不同浓度IL-1 β对成牙骨质细胞的影响方法:采用永生化小鼠成牙骨质细胞系OCCM-30,将细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔培养板中,待其长到100%后,采用不同浓度（0、5、20、40ng/mL）的IL-1 β处理24小时,通过real-time PCR检测IL-6和IL-1 β的变化。结果:不同浓度的IL-1 β作用24小时下,成牙骨质细胞中IL-1 β和IL-6的mRNA表达含量均有增加,且随着IL-1β刺激的浓度上升,成牙骨质细胞中IL-1β和IL-6的表达含量升高得越多。实验二:IL-1 β作用不同时间对成牙骨质细胞的影响方法:将小鼠成牙骨质细胞以5×105个每孔的密度接种于6孔培养板中,待其长到100%后,采用20ng/mL的IL-1 β处理不同时间（0、1、3、6、9、12、24小时）后同时收样,并通过real-time PCR和ELISA检测IL-6、TNF-α和IL-1β的变化。结果:1)用20ng/mL的IL-1 β刺激0-24小时,成牙骨质细胞中IL-6的mRNA和蛋白表达量均增加,且在6-9小时的mRNA含量达到最高值,6-12小时的蛋白含量达到最高值。2)20ng/mL的IL-1β刺激0-24小时内,成牙骨质细胞中IL-1 β的mRNA和蛋白表达含量均增加,并在9-12小时时达到最高值。3)20ng/mL的IL-1β刺激0-24小时的时间范围内,成牙骨质细胞中TNF-α的mRNA表达量增加,而蛋白含量无明显变化。实验三:不同浓度IL-1 β对小鼠成牙骨质细胞增殖的影响方法:将小鼠成牙骨质细胞以5000个每孔的密度接种于4个96孔微板中,分别用0、10、20、40ng/mL的IL-1 β刺激0、24、48、72小时并用CCK-8试剂和酶标仪记录吸光度,计算各组细胞数量变化趋势。结果:在72小时的范围内,不同浓度的IL-1β刺激对小鼠成牙骨质细胞的增殖速度没有明显影响。第二部分:IL-1 β与成牙骨质细胞中炎症因子关联的信号通路目的:探究IL-1 β作用下的成牙骨质细胞中,炎症相关通路NF-κB、ERK1/2、p38 MAPK的变化及其机制。实验一:IL-1β刺激对成牙骨质细胞中NF-κB、ERK1/2、p38 MAPK通路的影响方法:将小鼠成牙骨质细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔培养板中,待其长到100%后分为三组,一组采用NF-κ B通路化学阻断剂BAY 11-7082、p38通路化学阻断剂SB203580,ERK1/2通路化学阻断剂PD98059分别预处理细胞1小时,一组为不做任何处理的空白组,另一对照组加入相同体积阻断剂对照的DMSO;采用20ng/mL的IL-1 β处理所有细胞15分钟,同时收样并用western blot检测 total-NF-κB p65、p-p65、total-ERK1/2、p-ERK1/2、total-p38 MAPK、p-p38信号分子的表达情况。结果:1)在0-15分钟内,IL-1β刺激增强了小鼠成牙骨质细胞中p-p65、p-p38、p-ERK1/2信号分子的蛋白表达水平,且随时间增加而增强。但total-p65、total-p38、total-ERK1/2无明显变化。2)采用化学通路阻断剂BAY 11-7082、SB203580、PD98059 预处理 1 小时后,IL-1 β 刺激 0-15 分钟下小鼠成牙骨质细胞中p-p65、p-ERK1/2、p-p38的表达水平显著低于未使用化学通路阻断剂的细胞。实验二:IL-1 β刺激下阻断NF-κB、ERK1/2、p38 MAPK通路对IL-1 β和IL-6的影响方法:采用NF-κ B通路化学阻断剂BAY 11-7082、p38通路化学阻断剂SB203580,ERK1/2通路化学阻断剂PD98059分别预处理细胞1小时,并用20ng/mL IL-1β刺激12小时后,通过ELISA的方法检测成牙骨质细胞中IL-1β和IL-6表达情况。结果:与对照组相比,NF-κ B、p38 MAPK、ERK1/2化学阻断组细胞中IL-6的含量均有下降。除NF-κB化学阻断组细胞中IL-1β的含量有所下降,其他化学阻断组与对照组相比IL-1β含量无明显变化。第三部分:miR-146a-5p参与调控成牙骨质细胞炎症反应目的:探究小鼠成牙骨质细胞在炎症状态下miR-146a-5p的表达含量变化及miR-146a-5p在细胞炎症反应中作用的通路机制。实验一:不同浓度、时间IL-1β刺激成牙骨质细胞中miR-146a-5p的含量变化方法:将小鼠成牙骨质细胞接种于6孔培养板中,待其长到100%后,采用1)不同浓度（0、5、20、40ng/mL）的 IL-1β 处理 24 小时 2)20ng/mL 的 IL-1β处理不同时间（0、1、3、6、9、12、24小时）后收样,通过real-time PCR检测miR-146a-5p在细胞中的含量。结果:0-40ng/mL的IL-1 β作用24小时下,成牙骨质细胞中miR-146a-5p的表达含量均有增加,且表现出浓度的依赖性;浓度越大,表达含量越高。20ng/mL的IL-1β刺激0-24小时的时间范围内,成牙骨质细胞中miR-146a-5p的含量增加,且表现出随时间增长而含量升高。实验二:IL-1 β影响成牙骨质细胞中miR-146a-5p含量的途径方法:采用NF-κ B通路化学阻断剂BAY 11-7082、p38 MAPK通路化学阻断剂SB203580,ERK1/2通路化学阻断剂PD98059,预处理细胞1小时,并用20ng/mL IL-1 β刺激12小时后,通过real-time PCR的方法检测细胞中miR-146a-5p的表达情况。结果:与对照组相比,NF-κ B化学阻断组的细胞中miR-146a-5p的含量明显降低,p38 MAPK、ERK1/2化学阻断组细胞中miR-146a-5p的含量无明显变化。实验三:miR-146a-5p对IL-1 β刺激成牙骨质细胞中IL-6和IL-1 β的影响方法:将小鼠成牙骨质细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔培养板中,培养约10小时,待其长到30-50%时,采用瞬时转染的方法,将miR-146a-5p的mimic、mimic NC、inhibitor、inhibitor NC 的 siRNA 分别转染 24 小时后,采用 20ng/mL的IL-1 β处理12小时后收样,通过real-time PCR检测miR-146a-5p表达量以验证转染效率,并通过real-time PCR、ELISA检测细胞中IL-1β、IL-6的含量。结果:real-time PCR结果验证了本实验中siRNA转染效率稳定。与对应的NC组相比,在细胞转染mimic后,IL-1 β促进小鼠成牙骨质细胞表达的IL-1β、IL-6的含量下降;在细胞转染inhibitor后,IL-1β促进细胞表达的IL-1 β、IL-6含量均上升。实验四:miR-146a-5p对IL-1β刺激成牙骨质细胞影响炎症因子的通路方法:将小鼠成牙骨质细胞接种于6孔培养板中培养约10小时,待其长到30-50%时,将 miR-146a-5p 的 mimic、mimic NC、inhibitor、inhibitor NC 的siRNA分别瞬时转染24小时后,采用20ng/mL的IL-1β处理24小时后收样,通过western blot检测细胞中IRAK1、TRAF6和I κ Bα蛋白的表达含量。结果:western blot结果表明,与对应的NC组相比,在细胞转染mimic后,IL-1 β促进小鼠成牙骨质细胞表达的IRAK1、TRAF6的含量下降;在细胞转染inhibitor后,IL-1 β促进细胞表达的IRAK1、TRAF6含量均上升。结论:1)IL-1β能增加小鼠成牙骨质细胞炎症相关细胞因子IL-1 β和IL-6的分泌,促进细胞的炎症反应,且表现出时间和浓度的依赖性;IL-1β对成牙骨质细胞的增殖没有明显影响。2)IL-1β作用下,小鼠成牙骨质细胞中的炎症相关通路NF-κ B、ERK1/2和p38 MAPK通路被激活。3)抑制 NF-κ B、p38 MAPK、ERK1/2,细胞中IL-6的含量下降;抑制 NF-κ B,细胞中IL-1 β的含量有所下降,而抑制p38 MAPK、ERK1/2通路对细胞中IL-1β的含量无明显影响。4)IL-1β刺激下,成牙骨质细胞中miR-146a-5p表达含量增加,且表现出浓度和时间的依赖性。5)miRNA-146a-5p可使IL-1 β刺激下小鼠成牙骨质细胞分泌IL-6和IL-1β的含量降低,且这个过程可能是通过NF-κ B通路达成的。6)miRNA-146a-5p可能通过抑制 IRAK1/TRAF6抑制 NF-κ B 通路使 IL-1β刺激小鼠成牙骨质细胞分泌的IL-6和IL-1β减少。