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硫酸乙酰肝素/肝素是一种天然多糖，是由糖醛酸和葡糖胺以1-4糖苷键连接的线性糖胺聚糖，具有抗血栓、抗凝血、抗病毒、抗肿瘤等生物学活性，自发现至今仍是国内外研究的热点。肝素制备的传统方法是以动物组织为原料提取得到，并可降解为特定大小或功能的产物。考虑到此类动物源肝素存在病毒感染、引入杂质等安全风险，开发非动物源肝素合成技术对肝素基础生物学研究和临床应用将具有里程碑式的意义。
除了单纯的化学法合成，非动物源肝素的生物法合成主要有两种途径:①以大肠杆菌K5发酵得到的肝素前体为原料，经化学法和肝素修饰酶修饰得到肝素多糖产物;②以糖基供体为原料从头合成肝素骨架，再以PAPS为硫酸基供体，在肝素修饰酶催化下最终得到结构确定的肝素寡糖。以上生物合成方法均己取得进展，但尚未实现大规模制备，主要限制因素为肝素修饰酶在大肠杆菌E coli中的表达产量不高、活性偏低、纯化费时繁琐，酶催化的修饰反应不完全、有副产物生成，难以进行纯化。针对上述问题，本学位论文围绕肝素修饰酶在昆虫细胞中的表达及其在寡糖合成中的应用开展研究，研究内容及取得的成果如下:
通过无缝克隆技术将人C5-epi、鸡HS2ST和鼠HS6ST-1、人HPA基因克隆至pFastBacl质粒构建重组载体，转化至含杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10αBac感受态细胞并发生位点特异性转座，经抗性和蓝白斑筛选获得重组穿梭质粒Bacmid-C5-epi、Bacmid-HS2ST、Bacmid-HS6ST-1、Bacmid-HPA、Bacmid-GFP（阳性荧光对照）;在脂质体介导下将穿梭质粒转染昆虫细胞Sf9产生重组病毒，扩增病毒感染昆虫细胞Sf9进行蛋白表达;采用Western Blot鉴定Sf9培养上清中C5-epi、HS2ST、HS6ST-1、HPA的表达情况，分别以合成的肝素五糖、八糖为底物测定重组C5-epi、HS2ST、HS6ST-1、HPA酶的催化活性。
为优化表达重组修饰酶条件，首先采用终点稀释法和Reed-Muench两氏计算法测得P3代病毒的半数细胞培养感染剂量TCID50=10-675/0.01ml，滴度为pfu=108.6/ml;接着在不同感染时间(TOI)条件F以P3代重组病毒感染Sf9细胞，收集细胞上清进行Westem Blot鉴定和活性测定，发现TOI为72h时，蛋白表达量最高、没有杂带，且活性最高;然后以不同感染复数(MOI)的P3代重组病毒感染Sf9细胞72h，收集的上清进行Western Blot鉴定和活性测定，发现MOI为1时，蛋白表达水平高且酶活性最好，综上T0I=72h、MOI=1.0为活性重组酶表达的最佳表达条件。
由于在重组修饰酶蛋白的N-端引入6×His标签，因此细胞上清液采用Ni-NTA亲和层析柱纯化后，得到了纯度分别为93％的C5-epi、HPA、95％的HS6ST-1和97％HS2ST。分别与大肠杆菌表达的肝素修饰酶进行酶比活比较证实:纯化后的C5-epi的酶比活达118.57U/μg，是大肠杆菌表达产物的27.32倍;纯化后的HS2ST的酶比活达29.38U/μg，是大肠杆菌表达产物的1.31倍，且修饰肝素寡糖时无副产物产生，而大肠杆菌表达的HS2ST有4个修饰副产物;纯化后的HS6ST-1的酶比活达42.31U/μg，是大肠杆菌表达产物的6.81倍。因此，在Sf9昆虫细胞中分泌表达得到活性高的重组C5-epi、HS2ST、HS6ST-1酶，适合用于肝素/硫酸乙酰肝素寡糖的高效合成和规模化制备。
通过分步盐析-热变性制得的UDP-Glc脱氢酶粗品催化，合成了纯度为99.37％糖基供体UDP-GlcA;利用大肠杆菌表达的NahK、GlmU、PPA合成纯度为94.56％的糖基供体UDP-GlcNTFA。再以GIcA-PNP单糖作为起始原料，经过糖基转移酶KfiA和PmHS2的催化，在其非还原端交替增添GlcNTFA或GIcA，最终合成经MS验证的、纯度为98.24％的肝素五糖骨架GIcA-GIcNTFA-GIcA-GIcNTFA-GIcA-PNP;再通过化学法脱去TFA，并在NST酶的作用下使其发生N-硫酸化修饰，最终得到经MS验证的、纯度为98.33％的GIcA-GIcNS-GIcA-GlcNS-GIcA-PNP（简称5mer-NS）。
以5mer-NS为底物，在未纯化的表达C5-epi和HS2ST酶的昆虫细胞上清液的共同作用下，一步实现异构化和硫酸化修饰，最终得到经MS验证的、纯度为98.81％的产物GIcA-GIcNS-IdoA2S-GIcNS-GIcA-PNP（简称5mer-NS-IdoA2S）;进而再以Smer-NS-IdoA2S为底物，在未纯化的表达HS6ST-1酶的昆虫细胞上清液的作用下，发生硫酸化修饰，最终得到纯度为99.27％的GIcA-GicNS6S-IdoA2S-GicNS6S-GIcA-PNP（简称Smer-NS6S-IdoA2S）。因此，昆虫细胞分泌表达的肝素修饰酶无需纯化，能高效、低成本地催化肝素寡糖的修饰，解决了大肠杆菌表达肝素修饰酶的困扰，为规模化合成结构丰富的肝素寡糖奠定基础。
除了单纯的化学法合成，非动物源肝素的生物法合成主要有两种途径:①以大肠杆菌K5发酵得到的肝素前体为原料，经化学法和肝素修饰酶修饰得到肝素多糖产物;②以糖基供体为原料从头合成肝素骨架，再以PAPS为硫酸基供体，在肝素修饰酶催化下最终得到结构确定的肝素寡糖。以上生物合成方法均己取得进展，但尚未实现大规模制备，主要限制因素为肝素修饰酶在大肠杆菌E coli中的表达产量不高、活性偏低、纯化费时繁琐，酶催化的修饰反应不完全、有副产物生成，难以进行纯化。针对上述问题，本学位论文围绕肝素修饰酶在昆虫细胞中的表达及其在寡糖合成中的应用开展研究，研究内容及取得的成果如下:
通过无缝克隆技术将人C5-epi、鸡HS2ST和鼠HS6ST-1、人HPA基因克隆至pFastBacl质粒构建重组载体，转化至含杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10αBac感受态细胞并发生位点特异性转座，经抗性和蓝白斑筛选获得重组穿梭质粒Bacmid-C5-epi、Bacmid-HS2ST、Bacmid-HS6ST-1、Bacmid-HPA、Bacmid-GFP（阳性荧光对照）;在脂质体介导下将穿梭质粒转染昆虫细胞Sf9产生重组病毒，扩增病毒感染昆虫细胞Sf9进行蛋白表达;采用Western Blot鉴定Sf9培养上清中C5-epi、HS2ST、HS6ST-1、HPA的表达情况，分别以合成的肝素五糖、八糖为底物测定重组C5-epi、HS2ST、HS6ST-1、HPA酶的催化活性。
为优化表达重组修饰酶条件，首先采用终点稀释法和Reed-Muench两氏计算法测得P3代病毒的半数细胞培养感染剂量TCID50=10-675/0.01ml，滴度为pfu=108.6/ml;接着在不同感染时间(TOI)条件F以P3代重组病毒感染Sf9细胞，收集细胞上清进行Westem Blot鉴定和活性测定，发现TOI为72h时，蛋白表达量最高、没有杂带，且活性最高;然后以不同感染复数(MOI)的P3代重组病毒感染Sf9细胞72h，收集的上清进行Western Blot鉴定和活性测定，发现MOI为1时，蛋白表达水平高且酶活性最好，综上T0I=72h、MOI=1.0为活性重组酶表达的最佳表达条件。
由于在重组修饰酶蛋白的N-端引入6×His标签，因此细胞上清液采用Ni-NTA亲和层析柱纯化后，得到了纯度分别为93％的C5-epi、HPA、95％的HS6ST-1和97％HS2ST。分别与大肠杆菌表达的肝素修饰酶进行酶比活比较证实:纯化后的C5-epi的酶比活达118.57U/μg，是大肠杆菌表达产物的27.32倍;纯化后的HS2ST的酶比活达29.38U/μg，是大肠杆菌表达产物的1.31倍，且修饰肝素寡糖时无副产物产生，而大肠杆菌表达的HS2ST有4个修饰副产物;纯化后的HS6ST-1的酶比活达42.31U/μg，是大肠杆菌表达产物的6.81倍。因此，在Sf9昆虫细胞中分泌表达得到活性高的重组C5-epi、HS2ST、HS6ST-1酶，适合用于肝素/硫酸乙酰肝素寡糖的高效合成和规模化制备。
通过分步盐析-热变性制得的UDP-Glc脱氢酶粗品催化，合成了纯度为99.37％糖基供体UDP-GlcA;利用大肠杆菌表达的NahK、GlmU、PPA合成纯度为94.56％的糖基供体UDP-GlcNTFA。再以GIcA-PNP单糖作为起始原料，经过糖基转移酶KfiA和PmHS2的催化，在其非还原端交替增添GlcNTFA或GIcA，最终合成经MS验证的、纯度为98.24％的肝素五糖骨架GIcA-GIcNTFA-GIcA-GIcNTFA-GIcA-PNP;再通过化学法脱去TFA，并在NST酶的作用下使其发生N-硫酸化修饰，最终得到经MS验证的、纯度为98.33％的GIcA-GIcNS-GIcA-GlcNS-GIcA-PNP（简称5mer-NS）。
以5mer-NS为底物，在未纯化的表达C5-epi和HS2ST酶的昆虫细胞上清液的共同作用下，一步实现异构化和硫酸化修饰，最终得到经MS验证的、纯度为98.81％的产物GIcA-GIcNS-IdoA2S-GIcNS-GIcA-PNP（简称5mer-NS-IdoA2S）;进而再以Smer-NS-IdoA2S为底物，在未纯化的表达HS6ST-1酶的昆虫细胞上清液的作用下，发生硫酸化修饰，最终得到纯度为99.27％的GIcA-GicNS6S-IdoA2S-GicNS6S-GIcA-PNP（简称Smer-NS6S-IdoA2S）。因此，昆虫细胞分泌表达的肝素修饰酶无需纯化，能高效、低成本地催化肝素寡糖的修饰，解决了大肠杆菌表达肝素修饰酶的困扰，为规模化合成结构丰富的肝素寡糖奠定基础。