扶正抑癌方对结肠癌Iovo细胞EMT的影响及机制研究

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目的:通过观察细胞的形态变化和检测细胞运动、侵袭能力和E-cad和N-cad蛋白的表达变化,明确扶正抑癌方对结肠癌lovo细胞EMT的调控作用;通过检测TGF-β/Smad信号转导通路中TGF-β1、TβRⅡ、Smad3、p-Smad3和转录因子Snail蛋白水平的变化,阐明扶正抑癌方对EMT调控的分子作用机制,从而最终阐明中药抗肿瘤转移的科学内涵。   方法:   1.制备不同浓度(大、中、小剂量)的扶正抑癌方含药血清,lovo细胞体外培养。   2.通过MTT实验检测不同浓度扶正抑癌方含药血清对结肠癌lovo细胞24、48小时增殖能力的影响。   5.通过Transwell实验检测各组细胞侵袭能力。   6.通过免疫荧光法检测各组细胞上皮标志性蛋白E-cad和间质标志性蛋白N-cad的表达。   7.通过SABC免疫组化法检测各组细胞TGF-β1和TβRⅡ的蛋白表达。   8.通过western blot方法检测各组细胞Smad3和p-Smad3蛋白和转录因子Snail蛋白水平的变化。   9.统计方法采用SPSS15.0软件分析,组间差异采用单因素方差分析,P<0.05为差异具有统计学意义,各组实验数据以平均值±标准差((x)±s)表示。   结果:   1.根据MTT实验结果,大剂量含药血清组24h对lovo细胞抑制率较中剂量、小剂量组更加明显,差异具有统计学意义(P<0.01)。   2.Transwell实验和运动实验结果表明:扶正抑癌方含药血清能显著降低细胞的运动能力和侵袭能力,与正常组和空白组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。   3.免疫组化结果提示扶正抑癌方含药血清能够降低lovo细胞TGF-β1的蛋白表达,与正常组和空白组比较,差异具有统计学意义(P<0.01)。   4.免疫荧光结果表明扶正抑癌方含药血清能下调lovo细胞N-cad的表达和上调E-cad表达,与正常组和空白组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。   5.western blot检测结果表明扶正抑癌方含药血清能下调lovo细胞Smad3和p-Smad3的蛋白表达,与正常组和空白组比较差异具有统计学意义(P<0.05),另扶正抑癌方含药血清能下调转录因子Snail蛋白表达,与其它三个对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。   结论:   1.扶正抑癌方含药血清能够抑制结肠癌lovo细胞的增殖,大剂量组24小时内效果明显。   2.扶正抑癌方含药血清能够抑制lovo细胞发生EMT转变:表现为细胞的迁移和浸润能力下降;E-cad蛋白表达上调和N-cad表达下调。   3.扶正抑癌方含药血清通过调控TGF-β/smad信号转导通路和转录因子Snail的蛋白水平抑制lovo细胞发生EMT:表现为下调通路中的TGF-β1、Smad3和p-Smad3的蛋白表达和下调转录因子Snail的蛋白水平。
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