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溪荪(Iris sanguinea)与玉蝉花(I.ensata)是鸢尾科鸢尾属中非常耐寒的多年生草本植物,其花型奇特,观赏价值极高,在北方地区有着广阔的应用前景,为了今后开展基因工程育种,本课题组前期已开展了这两个种的组培体系构建,但在基因工程育种中高效的组培体系更有利于提高转基因材料的分化率,故本研究又尝试采用不同的外植体材料构建愈伤诱导率和分化率都比较高的组培体系,并尝试进行其遗传转化体系的建立,研究成果可为将来的分子育种工作奠定基础。主要研究成果如下:1.建立以玉蝉花根段为外植体的高效组培体系:选择成熟的玉蝉花种子,种子消毒后剥除种皮,将处理好的种子接入固体培养基MS+3.5 g/L琼脂中培养20d,获得无菌幼苗。将长有3-4片叶的幼苗接入固体培养基MS+活性炭1.0 g/L+4.0 g/L琼脂,培养20-25d,选择不定根中间带有幼嫩须根的部位作为外植体,须根切口处产生愈伤组织。愈伤诱导的最佳培养基为 MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+7.0 g/L琼脂,诱导率为100.00%;愈伤增殖的最佳培养基为MS+6-BA0.2 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+8.0 g/L琼脂,增殖系数为9.83;愈伤增殖过程中若产生内生菌,则抑菌的适宜培养基是 MS+6-BA 0.2 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+青霉素 G 钠100 mg/L,抑菌率为86.67%,愈伤接入抑菌培养基后观察培养,待内生菌消失后,愈伤组织移回增殖培养基中;最佳分化培养基为MS+6-BA2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+8.0 g/L琼脂,分化率为73.33%;最佳生根培养基为MS+NAA 0.5 mg/L+活性炭1.0 g/L+4.0 g/L琼脂,生根系数最高,为9.37,生根率为100.00%;炼苗3d后苗栽培在草炭土:蛭石=1:1的基质中,炼苗及移栽后生长过程中均需向苗的周围及空气中喷水,喷洒频率为1d/次,30d后苗的成活率为100.00%。2.建立以溪荪不同器官为外植体的高效组培体系:以溪荪胚轴为外植体,愈伤诱导的最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 1.5 mg/L+7.0 g/L琼脂,诱导率最高值为95.38%;适宜的增殖培养基为 MS+6-BA0.5 mg/L+2,4-D 0.3 mg/L+8.0 g/L 琼脂,增殖系数为 5.79;不定芽分化培养基为 MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+8.0 g/L琼脂,培养50d后,愈伤分化率最高为71.67%;不定芽的生根培养基同玉蝉花,生根系数为8.53,生根率为100.00%。以溪荪不定根中间带有幼嫩须根的部位为外植体,愈伤诱导培养基MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L,培养 30d 后诱导率为 91.11%;培养基 MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+青霉素G钠100 mg/L是愈伤增殖过程中抑菌的适宜培养基,抑菌率为93.94%;分化培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L,分化率最高为71.67%;不定芽的生根培养基同玉蝉花,生根系数为4.37。两种外植体材料的适宜生根培养均为MS+NAA 0.5 mg/L+活性炭1.0 g/L,生根率为100.00%。炼苗3d后移栽于基质中,20d后成活率100.00%,期间炼苗方式、栽培基质及移栽后管理方法同玉蝉花。3.溪荪遗传转化体系的初探:以溪荪不定根中间带有幼嫩须根的部位为转化受体,预培养的培养基为 MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L,预培养 2d 为宜;转化受体经菌液侵染2.0min后,28℃恒温黑暗条件共培养1d更利于诱导带有GUS基因的愈伤组织,其共培养的培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L,附加 100 umol/L AS;其恢复诱导培养基为 MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L,附加Card 100 mg/L,诱导30d,诱导获得的愈伤组织经GUS染色液染色鉴定后,全部变蓝,转化率为51.11%;愈伤组织进行分化筛选,培养基为MS+6-BA2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L,附加Kana 30 mg/L和Card 300 mg/L,分化40d后,不定芽分化率为3.33%,产生的不定芽经染色鉴定后,出现蓝色斑点,确定为阳性不定芽,但后期不定芽死亡,并未产生抗性植株。以溪荪胚轴诱导出的愈伤作为转化受体,经菌液侵染2.0min后,28℃恒温黑暗条件共培养2d,其共培养的培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.3 mg/L,附加100 umol/L AS;转化受体经共培养后接入分化筛选培养基MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L,附加Kana 30 mg/L和Card 300 mg/L,培养20d后进行GUS染色鉴定,阳性组织被染成蓝色,抗性愈伤获得率为46.67%,但培养35d时分化产生不定根,出现畸形分化,染色后发现该组织中不存在GUS基因。4.玉蝉花遗传转化体系的初探:以玉蝉花不定根中间带有幼嫩须根的部位为转化受体,预培养的培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L,预培养2d为宜:转化受体经菌液侵染1.5 min后,28℃恒温黑暗条件共培养1d更利于诱导带有GUS基因的愈伤组织,其共培养的培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L,附加 100 umol/LAS;其恢复诱导培养基为 MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L,附加Card 300 mg/L,诱导30d,诱导获得的愈伤组织经GUS染色液染色鉴定后,全部变蓝,转化率为31.11%;愈伤组织进行分化筛选,培养基为MS+6-BA2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L,附加 Kana 30 mg/L 和 Card 300 mg/L,分化 20d 后时,愈伤表面产生绿点,出现分化趋势,但培养40d后愈伤没有进一步分化,而是逐渐褐化死亡。