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研究背景强直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis,AS）是一种原因不明的、以中轴关节内炎症,骶髂关节炎和附着点炎症为主要特征的炎症性自身免疫性疾病。既往研究显示AS的发病与遗传因素有关,其中最典型的基因就是人类白细胞抗原（Human leukocyte antigen,HLA）-B27基因。然而,这些研究主要集中于探讨具有蛋白质编码特性的基因对AS发病的影响,因此这些研究没有帮助我们完全了解AS的发病机制,而自身免疫炎症性疾病的遗传背景一般都十分复杂,常涉及基因组中的编码基因和非编码基因以及这两种基因的交互作用。近年来,大量研究发现长链非编码RNA（Long non-oding RNA,lnc RNA）和微小RNA（micro RNA,mi RNA）在类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）,骨关节炎（Osteoarthritis,OA）系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）和AS等自身免疫病中表达异常,且竞争性内源性RNA（Competing endogenous RNA,ce RNA）的假说更是极大地推动了lnc RNA和mi RNA在疾病中的研究。然而,较少有研究关注lnc RNA和mi RNA以及它们的相互作用是如何参与到AS的发病和疾病进展。本研究的目的就是为了探讨lnc RNA H19与mi R22-5p和mi R675-5p在AS发病机制中的作用。研究方法本次研究主要包括三部分:（1）首先,我们从5例AS患者和5例健康对照（年龄和性别与AS患者相匹配）外周血中提取外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMCs）,并用lnc RNA芯片分别检测两组人群PBMCs中lnc RNA的表达水平,构建差异表达的lnc RNA表达谱。（2）随后扩大样本量对芯片结果进行验证,在49例AS患者和49例健康对照（年龄和性别与AS患者相匹配）的PBMCs中,采用实时定量PCR（Real-time PCR,q RT-PCR）检测四个差异表达的lnc RNAs水平,并确定本次研究的目标lnc RNA。此外,在此大样本人群中,我们还检测了相关的信使RNA（Messenger RNA,m RNA）的表达水平。然后,用在线的软件RNAhybrid预测与lnc RNA潜在相关的mi RNA,并进一步预测与mi RNA潜在相关的m RNA。（3）最后,我们从8例AS患者中提取原代PBMCs进行细胞培养,并添加植物凝集素（Phytohemagglutinin,PHA）刺激细胞数量增多,从而进行后期的功能实验。在PBMCs中进行腺病毒转染和si RNA干扰等技术来改变lnc RNA和mi RNA的表达水平,随后用q RT-PCR检测lnc RNA,mi RNA和m RNA以及下游分子的RNA表达水平;用Western blot检测m RNA对应的蛋白水平;用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定细胞因子水平。此外,采用双荧光素酶报告基因实验检测lnc RNA与mi RNA的结合位点荧光活性,以及mi RNA与m RNA结合位点的荧光活性。统计分析阶段,采用Kolmogorov Smirnov检验来判断连续性变量是否符合正态分布。符合正态分布的定量资料组间的比较采用Student-T检验,而不符合正态分布的定量资料组间的比较采用Mann-Whitney U检验。分类资料的组间差异采用Pearson卡方检验来比较。差异表达的lnc RNA是否可以作为AS的生物标志物的判定则应用受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic,ROC）及其曲线下的面积（Area under curve,AUC）大小来评估,并进一步确定本研究的目标lnc RNA。Spearman秩相关用来探索lnc RNA和其他分子的相关性。所有统计分析均在SPSS 23.0版本软件中进行,Graph Pad Prism 5.01软件用于图片的绘制与合成。双侧P值小于0.05则认为差异具有统计学意义。研究结果芯片筛选部分,两组人群中男性均为3例（占60.0%）,AS患者年龄为（22.6±6.2）岁,健康对照人群的年龄为（25.2±6.6）岁;q RT-PCR验证部分,AS患者年龄为（33.9±11.7）岁,健康对照人群的年龄为（31.1±6.1）岁;AS组中男性患者32例（65.3%）,健康对照组中有25例（51.0%）男性;功能研究部分,患者的年龄为（27.5±5.9）岁,其中男性患者5例（62.5%）。前两部分中,病例和对照在性别和年龄方面差异均不具有统计学意义。芯片筛选发现AS患者中有154个差异表达的lnc RNA,其中,已经有注释信息的lnc RNA 42个,包括表达上调的lnc RNA 23个,表达下调的lnc RNA 19个。q RT-PCR结果显示,与健康对照组相比,H19和LOC101929023的表达水平在AS中上调,ROC结果显示H19的曲线下面积（AUC=0.653,P=0.009）要大于LOC101929023曲线下面积（AUC=0.637,P=0.020）,因此H19被选为本研究的目标lnc RNA用于后期的实验。在线的软件RNAhybrid预测得到mi R675-5p和mi R22-5p为H19的靶点mi RNA,VDR和TGF-β与mi R675-5p/mi R22-5p存在结合位点。q RT-PCR结果显示VDR和IL-17A的RNA表达水平在AS患者中显著上调,而TGF-β,IL-23和TNF-α差异不具有统计学意义;H19与上述5个m RNA表达水平存在较弱的正相关关系。体外实验研究结果显示,Si RNA-H19（Si-H19）显著降低了mi R22-5p表达水平,提高了mi R675-5p表达水平;且Si-H19显著降低了VDR的蛋白和m RNA表达,并降低了白细胞介素（Interleukin,IL）-17A和IL-23细胞因子和m RNA水平。上述这些结果得到了腺病毒-H19（Adenovirus-H19,AD-H19）的验证。此外,mi R22-5p和mi R675-5p抑制剂显著提高了VDR的蛋白和m RNA表达,且提高了IL-17A和IL-23的细胞因子和m RNA水平。这些结果也被mi RNA模拟物所证实。双荧光素酶报告基因结果显示,野生型的H19的荧光素酶活性显著的被mi R22-5p模拟物和mi R675-5p模拟物抑制,突变型的H19荧光素酶活性不被mi R22-5p模拟物所影响;且野生型的VDR的荧光素酶活性显著的被mi R22-5p模拟物和mi R675-5p模拟物抑制,突变型的VDR荧光素酶活性不被上述两种模拟物产生影响。研究结论本研究共发现42个已有注释信息的差异表达的lnc RNA,且lnc RNA H19在AS患者中表达上调。H19与mi R22-5p和mi R675-5p存在相互作用的结合位点,且VDR也与这两个mi RNA存在结合位点。因此,H19在AS患者发病过程中起着重要的作用,且其可以充当mi R22-5p-VDR-IL-17A/IL-23轴上的ce RNA,或者与mi R675-5p-VDR-IL-17A/IL-23通路上的mi R675-5p直接相互作用来促进患者炎症的进展。