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新城疫(Newcastle disease，ND)为能感染多种禽类的一种急性、高度传染性疫病，给世界养禽业造成巨大的经济损失。新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)属于副粘病毒科，禽腮腺炎病毒属，其基因组由单股负链RNA构成，基因组结构为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)，其中病毒囊膜表面的两种糖蛋白F和HN是构成NDV致病性的主要分子基础。本研究对2005-2008年间分离自华东地区的79株NDV的F基因和HN基因序列进行了测序和遗传进化分析，发现分离株在基因型和毒力上具有明显的多样性，但基因Ⅶd亚型仍然是我国流行的优势基因型；在NDV的遗传进化分析基础上，选取了三株不同遗传背景的NDV进行体内外的致病性试验，结果表明：基因Ⅶ型NDV对鸽、鸡和鹅均呈现出高致病性，鸽源Ⅵb亚型NDV具有明显宿主感染特异性；为了进一步探讨NDV在细胞分子水平上的致病机制以及三株NDV之间的致病性差异，本研究还运用比较蛋白质组方法对上述三株NDV感染细胞后的差异表达蛋白进行了初步分析。
1.2005-2008年我国华东地区新城疫病毒分离株的遗传进化分析
对2005-2008年间从我国华东地区发病的鸡、鹅、鸽等禽类中所分离出的79株NDV进行了生物学特性和基因型鉴定。F和HN基因的遗传进化分析结果一致表明：79个分离株中，有3株弱毒为classⅠ谱系；76株为classⅡ谱系，其中基因Ⅰ型NDV弱毒1株，基因Ⅱ型NDV弱毒12株，基因Ⅲ型NDV强毒2株，基因Ⅵ型中等毒力NDV4株，其它57株NDV强毒分离株均属于基因Ⅶd亚型。Ⅶd亚型毒株占到了所有分离强毒株的96％以上，表明Ⅶd亚型NDV仍然是我国当前流行的优势基因型。序列比对结果显示，基因Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型分离株与疫苗株V4、La Sota和Mukteswar的同源性分别为99.6％、96.2～99％和99.9％，由此，这些毒株可能来源于临床上广泛使用的疫苗株；4株基因Ⅵb亚型NDV均为鸽源分离株，暗示该亚型NDV具有强的宿主感染特异性。在遗传进化树上，57个Ⅶd亚型NDV可进一步分为Ⅶd1和Ⅶd2两个分支，近两年分离的大多数毒株属于Ⅶd2分支，与Ⅶd1分支中NDV相比，Ⅶd2中的NDV在F蛋白分别出现了4处突变：N145K、Q279H、K387R和F512I；在HN蛋白也出现3处突变，分别为：T102I、A118E和T443M。我国新城疫病毒分离株在毒力与基因型所呈现出的多样性，为研究不同遗传背景毒株之间的致病性差异提供了理想的生物材料。
2.不同遗传背景NDV体内外致病性
在NDV的遗传进化分析基础上选取鹅源毒株JS-5-05-Go(基因Ⅶd亚型)、鸽源毒株WX-10-07-Pi(基因Ⅵb亚型)和鸡源毒株JS-7-05-Ch(基因Ⅲ型)三个不同遗传背景的NDV进行体内外的致病性试验。三株不同遗传背景NDV均以0.01MOI接种量感染鸡胚成纤维细胞(CEF)、鸭胚成纤维细胞(DEF)和鹅胚成纤维细胞(GEF)，结果显示JS-5-05-Go感染三种细胞的上清HA峰值均比其它两株病毒高，WX-10-07-Pi感染后三种细胞上清HA峰值相同，JS-7-05-Ch感染后三种细胞上清HA峰值差异显著；三株NDV感染GEF细胞崩解过程均比DEF缓慢。动物试验中，我们以上述三株NDV和标准强毒株F48E8经自然感染途径分别感染鸽、SPF鸡和鹅三种试验动物，结果显示，仅JS-5-05-Go和F48E8引起感染鸽的死亡，且只有JS-5-05-Go和WX-10-07-Pi毒株导致鸽泄殖腔出现间歇排毒。WX-10-07-Pi攻毒组鸽泄殖腔排毒时间最长、且病毒检出率较其它组要高，因此与其它基因型NDV相比，基因Ⅵb亚型NDV更易在鸽群中感染传播。SPF鸡感染试验结果表明，JS-7-05-Ch虽为强毒株，但是对鸡的致病性较弱，但其余3株NDV对鸡的致病力与其毒力呈正相关。四株NDV对鹅的致病力差异显著，致病力从强到弱依次为F48E8、JS-5-05-Go、JS-7-05-Ch和WX-10-07-Pi，WX-10-07-Pi几乎不引发鹅的临床症状；F48E8和JS-5-05-Go试验组在9种脏器组织中病毒检测率、喉头和泄殖腔排毒差异不显著。
3.不同遗传背景新城疫病毒感染CEF的比较蛋白质组研究
为了在细胞蛋白水平研究三株不同遗传背景NDV和宿主细胞之间的相互作用关系，本研究以感染了NDV的CEF为研究对象，采用双向凝胶电泳(2-DE)结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定技术(MALDI-TOF-MS)的比较蛋白质组研究方法，分析三株NDV感染CEF后24h和48h两个时间点细胞蛋白表达动态。双向凝胶图谱的差异表达分析显示，CEF感染三株NDV后，共有43个蛋白点出现了显著的差异表达，包括持续上调、持续下调、先期上调后期下调以及先期下调后期上调四种表达方式，部分蛋白点在不同的感染组中表达水平有所差异。采用MALDI-TOF-MS质谱法对43个差异表达蛋白点进行质谱鉴定，结果成功鉴定了41个蛋白点，对应39种蛋白质。根据蛋白的功能不同，这些差异表达蛋白涉及病毒结构蛋白(2％)、细胞骨架(43％)、应激反应(10％)、蛋白质翻译和合成(7％)、RNA加工和合成(12％)、能量代谢(7％)、泛素-蛋白酶体途径(2％)、信号传导(12％)以及一些功能未知蛋白(7％)。应用Western-blot分析方法验证了β-actin和α-tubulin的蛋白表达水平，其结果与2-DE的分析数据完全相符。根据差异表达蛋白的功能，推测在新城疫病毒感染细胞时，病毒可通过热休克蛋白27(HSP27)、硫氧还蛋白域5(TXNDC5)和核磷蛋白(NPM1)等蛋白的上调表达来抑制或延缓细胞的早期凋亡；同时，翻译延长因子Tu(EF-Tu)和40S核糖体蛋白SA(PRSA)上调表达有利于病毒自身蛋白质的合成；另外，细胞对于NDV的感染也具有一定的防御机制，热休克蛋白90kDa(GRP94)上调表达导致细胞凋亡增加。
比较蛋白质给学试验结果显示，不同遗传背景NDV感染细胞中部分蛋白的表达水平存在明显差异。细胞微丝蛋白β-肌动蛋白(ACTB)和细胞质类型肌动蛋白8(ACTG8)、信号传导蛋白核仁素(C23)、含有TPR结构域的小的富含谷氨酰胺的蛋白(SGT)和14-3-3E蛋白(14-3-3E)以及参与蛋白翻译和合成的TXNDC5等与WX-10-07-Pi本身感染特性有关；细胞骨架蛋白中α-微管蛋白(TUBA)、角蛋白19(KRT19)、网素3(PLS3)和肌动蛋白加帽蛋白(CAPZA2)，RNA加工蛋白中的不均一核糖核蛋白K(hnRNPK)以及功能未知的类人含46卷曲螺旋结构域(CCDC46)等与JS-7-05-Ch自身感染特性有关；而细胞骨架蛋白中波形纤维蛋白(VIM)和B1-链微管蛋白(TUBA1C)、热应激蛋白Grp94、蛋白翻译蛋白EF-Tu以及早期内体抗原1(EEA1)等蛋白表达水平的变化与JS-5-05-Go本身感染特性有关。
全文小结：
(1)2005-2008年间共分离鉴定NDV79株，分离株在基因型和毒力上具有明显的多样性。基因Ⅶd亚型仍然是我国流行的优势基因型，该亚型目前已出现了Ⅶd1和基因Ⅶd2两个分支。
(2)基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型NDV田间分离株与当前使用的疫苗毒株关系密切，推测这些田间分离株是疫苗株的变异株。与其它基因型毒株相比，鸽源Ⅵb亚型NDV具有明显的宿主感染特异性。
(3)本研究首次应用比较蛋白质组方法研究不同遗传背景NDV感染CEF细胞后的差异表达的蛋白，质谱鉴定41个差异表达的蛋白，对应39种差异表达蛋白。
(4)NDV感染细胞后改变了细胞骨架、影响泛素-蛋白酶体途径的稳定、破坏了宿主翻译机制、抑制细胞RNA的加工和能量代谢。
(5)不同遗传背景NDV感染细胞后均出现与其本身特性相关的蛋白质。
(6)NDV除通过膜融合进入细胞外，还可能通过胞吞途径进入细胞。与其它两株病毒相比，胞吞作用在JS-5-05-Go进入细胞的过程中，可以发挥更长时间的效应。