目的:乳腺癌已成为女性发病率最高的恶性肿瘤,并呈逐年升高趋势,虽然采取以手术为主的综合治疗措施,但其远期生存率并没有获得明显提高,影响预后的主要因素是发生了远处器官的转移。据临床资料统计显示,约有25~30%腋淋巴结阴性的乳腺癌患者,于术后5年内出现远处转移而导致治疗失败,如果能在早期检测到微小转移灶,则对疾病的分期、治疗及改善预后具有重要意义。骨髓是乳腺癌最易发生转移的部位,骨髓微转移(bone marrow micrometastasis, BMM)的检测较腋窝淋巴结和外周血更能反映肿瘤细胞的全身播散情况,不仅能动态监测转移、观察疗效,并可成为预测乳腺癌预后的独立因素。因此,对于远处微小转移灶的早期检测及治疗成为提高乳腺癌患者远期生存率的主要途径之一。造成乳腺癌患者治疗后复发和转移的主要原因是机体免疫力低下及肿瘤的免疫逃逸机制。因此,免疫治疗正逐渐成为肿瘤综合治疗的研究热点,有望成为肿瘤治疗的又一主要手段。免疫治疗中常用的活性细胞有:淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)和特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。有报道提出,利用树突状细胞(dendritic cell, DC)的高抗原递呈活性,将乳腺癌细胞抗原肽负载DC,从而激活机体免疫反应,可促进抗瘤效应和特异性。树突状细胞作为唯一的专职抗原递呈细胞(antigen processing cell, APC),处于免疫反应的中心地位。非成熟的DC捕获抗原后被激活成为成熟的DC,其细胞表面表达MHCⅠ类和Ⅱ类分子、共刺激分子B7-1(CD80)和B7-2(CD86)、黏附分子CD54(ICAM-1)和CD50(ICAM-3)等,并将抗原肽递呈给CD4+和CD8+T细胞,诱导其成为特异性细胞毒性T细胞(CTL),分泌细胞因子(如IL-12等),产生Th1型免疫应答而发挥抗肿瘤作用。我们采用免疫磁珠(IMB)富集,联合扫描电镜(SEM)及激光共聚焦显微镜(LSM),检测了乳腺癌患者骨髓微转移(BMM);从乳腺癌患者腋窝区域引流淋巴结单个核细胞中,诱导培养DC和肿瘤抗原特异性CTL,通过体外和乳腺癌荷瘤裸鼠体内杀伤实验,以期寻找一种治疗乳腺癌微转移的新途径。方法:第一部分IMB联合SEM、LSM检测乳腺癌骨髓微转移选取2006年3月至10月我院收治的乳腺癌患者45例,健康志愿者4例(均签署了骨髓穿刺知情同意书)。研究对象均为女性,年龄30～67岁,平均49.8岁。术前在局部浸润麻醉下,行髂前上棘骨髓穿刺,抽取骨髓10~15ml,应用淋巴细胞分离液分离、收集有核细胞,IMB富集阳性对照、正常人对照、乳腺癌患者骨髓中转移的肿瘤细胞,将富集后细胞分成两等份,一份在SEM下采集肿瘤细胞图像,另一份用anti-CK-FITC标记细胞,在LSM下检测CK+细胞。将乳腺癌细胞株MDA-231制作成电镜标本,SEM下采集标准乳腺癌细胞的超微结构图象。第二部分乳腺癌腋下淋巴结来源的DCs对自体CTLs体外特异性杀伤活性的影响术中严格无菌摘取乳腺癌引流淋巴结1~2枚,用机械法获取淋巴细胞悬液,并用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,以含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬、培养2h,贴壁细胞以rhGM-CSF(1000U/ml), rhIL-4(200U/ml)和TNF-α(200U/ml)联合培养诱导DCs;非贴壁细胞,加入rhIL-2(200U/ml)培养为TDLNCs。用酶消化法将乳腺癌组织制备自体乳腺癌单细胞悬液,通过冻融法制备肿瘤抗原,负载DCs,将后者与TDLNCs共培养,以诱导肿瘤特异性CTLs。分别培养至第1天和第7天收获DCs,加入PE-CD1a、PE-CD83、FITC-CD86单克隆抗体,用流式细胞分析仪检测细胞表型;于第7天和第10天收获DC-TDLNCs,分别加入FITC-CD3单克隆抗体,FITC-CD4/PE-CD8二联抗体,检测其细胞表型。用非放射性细胞毒分析试剂盒,测定不同方法诱导的CTLs细胞对自体乳腺癌细胞和MCF-7细胞的体外杀伤活性,分析经诱导的DCs功能和CTLs杀伤特异性。第三部分自体肿瘤特异性CTLs对裸鼠乳腺癌模型抑瘤作用的研究手术时分别无菌切取2例乳腺癌患者癌组织,剪成约1mm3大小组织块。将32只3~4周龄BALB/c裸鼠随机分成4组,每组8只,癌组织分别种植于裸鼠胸垫部皮下,建立裸鼠乳腺癌模型,移植瘤生长2周后,每5天注射一次不同的免疫效应细胞。(1)肿瘤特异性CTL组:每只裸鼠局部注射肿瘤特异性CTLs 0.2ml(5×106/ml);(2)非特异性CTL组:每只裸鼠局部注射未经自体肿瘤冻融抗原激活的非特异性CTLs 0.2ml(5×106/ml);(3)异体CTL组(种植另一患者癌组织):每只裸鼠局部注射非自体肿瘤特异性CTLs 0.2ml(5×106/ml);(4)空白对照组:每只裸鼠移植瘤模型局部注射生理盐水0.2ml。每5天用游标卡尺测量肿瘤长径(a)、短径(b),按体积(V)=πab2/6计算肿瘤体积,并计算肿瘤生长抑制率,30天后处死裸鼠取出瘤块。将肿瘤组织放入福尔马林溶液中固定、脱水、石蜡包埋、切片。经常规HE染色,镜下观察肿瘤细胞形态;免疫组化染色,观察T细胞和树突状细胞浸润情况。结果:1 4份骨髓有核细胞中掺入乳腺癌细胞株MDA-231的阳性对照组,在SEM、LSM下均可检测到肿瘤细胞;4份正常人骨髓有核细胞在SEM、LSM下均未检测到肿瘤细胞。2 45例乳腺癌患者的骨髓标本中,有16例在SEM、LSM下同时检测到肿瘤细胞,BMM阳性检出率为35.6%。3乳腺癌患者的BMM阳性率随着原发肿瘤的增大而增高,肿瘤直径≤2cm组、2~5cm组及>5cm组的BMM阳性率分别为11.1%、30.8%、70.0%,三者之间均有显著性差异, P=0.020。4乳腺癌BMM阳性率随临床病理分期的增加而增高,临床Ⅰ期组BMM阳性率为20.0%、Ⅱ期组25.0%、Ⅲ期组87.5%,三者之间均有显著性差异, P=0.003。5有腋淋巴结转移的乳腺癌患者之BMM阳性率为48.0%,无转移组为20.0%,两者之间无统计学差异,P=0.053。经分层研究发现,随着腋淋巴结转移数目的增加BMM阳性率增高,腋淋巴结转移数目≥4个组的BMM阳性率为58.8%,高于腋淋巴结转移数目为1~3个组(25.0%)及无腋淋巴结转移组(20.0%),并均有显著性差异,P=0.038。6乳腺癌患者的BMM与患者的年龄、月经状况无关,P>0.05。7 BMM阳性率随乳腺癌组织学分级增加而升高,组织学分化Ⅰ级组BMM阳性率为9.1%,Ⅱ级组为33.3%,Ⅲ级组为61.5%,三者之间有显著性差异,P=0.027。BMM与乳腺癌的病理类型无关,P>0.05。8乳腺癌患者的BMM阳性率随肿瘤组织ER、PR蛋白表达的增强而降低,ER、PR阳性组BMM阳性率分别为18.2%、7.7%,低于ER、PR阴性组(52.2%、46.9%),P<0.05。乳腺癌患者的BMM与肿瘤组织C-erbB-2、VEGF的表达无关(P>0.05)。9乳腺癌患者腋下引流淋巴结中的单个核细胞(TDLNCS)用细胞因子(rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α)诱导培养后,可以形成具有成熟DC形态特点的细胞。10诱导前的TDLNCS中,DCs特异性表面标志物CD1a、CD83和CD86百分含量分别为10.98±2.38、26.55±5.24和32.96±6.09,经与rhGM-CSF、rhIL-4共同培养,并经自体肿瘤冻融抗原加TNF-α诱导后,DC-Ag-TDLNC细胞中CD1a、CD83和CD86百分含量明显增加,分别为50.17±5.68、60.48±16.46、56.22±16.38,P<0.01。11诱导前的TDLNCs中,CD3+和CD8+细胞含量分别为73.93±2.18和32.78±3.21;诱导后DC-Ag-TDLNC组中CD3+和CD8+细胞含量分别为82.67±2.79和62.54±2.51,诱导后CD3+、CD8+T细胞含量均明显升高, P<0.01。诱导前TDLNCs中CD4+细胞含量为27.3±2.58;诱导后DC-Ag-TDLNC组中CD4+细胞含量为17.49±4.21;DC-TDLNC组中CD4+细胞含量为19.49±2.12。三组细胞相比较,CD4+细胞含量无明显变化,P>0.05。12 DC-Ag-TDLNC细胞对自体乳腺癌细胞的杀伤率为67.64%;DC-TDLNC和TDLNC对自体乳腺癌细胞的杀伤率分别为31.25%、26.36%。DC-Ag-TDLNC、DC-TDLNC和TDLNC之间相比,对自体乳腺癌细胞的杀伤率逐渐降低,P<0.001;DC-TDLNC和TDLNC组间比较P<0.05。三组细胞对MCF-7细胞的杀伤率无明显差异,P>0.05。13人乳腺癌组织在裸鼠体内的移植瘤成活率为100%。14肿瘤特异性CTLs、非特异性CTLs及异体CTLs对裸鼠移植瘤的生长均有抑制作用,从移植瘤的第15天到第30天,各治疗组移植瘤体积均小于空白对照组,且都有显著性差异。对移植瘤生长的抑制作用以自体特异性CTL组最高,治疗15天后肿瘤体积平均为82.70±2.09mm3,小于非特异性CTL组(96.15±5.35mm3)和异体CTL组(96.93±4.51mm3),P =0.000;自体特异性CTL组抑瘤率(47.62%),明显高于非特异性CTL组(30.44%)和异体CTL组(24.69%)抑瘤率, P =0.000;15移植瘤标本经HE染色证实为乳腺浸润性导管癌。免疫组化表明,治疗组瘤组织可见大量淋巴细胞和树突状细胞浸润。结论:1 IMB联合SEM、LSM检测原发性乳腺癌BMM,阳性检出率为35.6%。2乳腺癌BMM与原发肿瘤大小及临床病理TNM分期有关,肿瘤的侵袭转移能力随着原发肿瘤增大而增强,临床分期越晚,出现骨髓转移几率越高。但肿块小、无淋巴结转移的Ⅰ期乳腺癌患者,亦存在约20%的BMM,提示乳腺癌是一种全身性疾病,转移及播散很早即可发生。3虽然乳腺癌BMM与腋淋巴结转移与否无明显相关性,但进一步分层研究发现,随着腋淋巴结转移数目的增加BMM阳性率增高,说明血行播散与淋巴结转移是乳腺癌转移的两条相对独立的途径,当腋窝淋巴结出现较多转移时,癌细胞可能通过淋巴导管再次入血从而增加了转移机会。4乳腺癌BMM阳性率随组织学分级增加而升高,说明分化程度低的肿瘤细胞具有更强的增殖、侵袭、转移能力,对这部分病人应加强化疗等综合性治疗,密切关注全身转移情况。5乳腺癌BMM阳性率随ER、PR蛋白表达增强而降低,说明分化愈差的肿瘤细胞,ER、PR丢失愈多,可能具有更强的增殖、侵袭、转移能力。6本研究未发现乳腺癌BMM与患者的年龄、月经状况、病理类型及肿瘤组织中C-erbB-2、VEGF的表达有关。7乳腺癌患者腋下引流淋巴结来源的单个核细胞,在rhGM-CSF、rhIL-4刺激活化和自体乳腺癌细胞冻融抗原及TNF-α作用下,可以诱导培养出具有典型细胞学形态特征和高表达DC特异性表面标志物的成熟DCs,并具有较强的抗原提呈功能,可以促进TDLNCs增殖、分化为肿瘤抗原特异性CTLs。8肿瘤抗原特异性CTLs对自体乳腺癌细胞有较高的体外杀伤效应,而对异体乳腺癌细胞不具有特异性杀伤效应。未经自体乳腺癌细胞冻融抗原刺激诱导的DCs虽也可以使TDLNCs增殖、分化为CTLs,但此CTLs不具有针对自体乳腺癌细胞的特异性杀伤效应,其对自体乳腺癌细胞的杀伤活性与以rhIL-2培养的TDLNCs相同。9自体肿瘤特异性CTLs对裸鼠体内自体移植瘤有较高的抑制作用。癌组织内有DCs和大量淋巴细胞浸润。