论文部分内容阅读
芳香化合物广泛存在于地球环境中，就天然有机物而言，其存量仅次于碳水化合物;许多芳香化合物来源于化学工业合成，例如农药、杀虫剂等，具有难生物降解的特性。因此，芳香化合物在环境中的分解途径及其分子中元素的地球化学循环过程，引起了广泛的关注。微生物具有丰富的代谢途径和快速的遗传变异及适应能力，在芳香化合物的生物降解过程中发挥着重要作用。苯甲酸（钠）作为最简单的芳香化合物，长期被用作防腐剂，广泛存在自然环境中;在复杂芳香化合物的分解过程中，苯甲酸是常见的重要中间产物，因此，苯甲酸也通常被用来作为模式化合物来研究微生物分解芳香化合物的基本代谢途径。 本研究以β-变形菌睾丸酮丛毛单胞菌CNB-1菌株为对象，对苯甲酸的降解过程进行了研究。通过对CNB-1菌株基因组数据的挖掘，发现CNB-1菌株中苯甲酸降解基因簇（box基因簇）由boxABC(CtCNB1_0065～CtCNB1_0067)和 bcl-boxD(CtCNB1_0097～CtCNB1_0098)及其调控蛋白基因boxR组成。通过对苯甲酸降解途径相关基因进行遗传敲除与互补，并对其编码产物进行异源表达、纯化和酶活检测，鉴定了该途径中相关蛋白的功能。CtCNB1_0097编码的苯甲酸辅酶A连接酶能够把苯甲酸活化为对应的硫酯物苯甲酰辅酶A;苯甲酰辅酶A氧化还原酶的还原酶组分BoxA蛋白和加氧酶组分BoxB蛋白分别由CtCNB1_0065和CtCNB1_0066编码，二者可以氧化苯甲酰辅酶A生成2，3-环氧苯甲酰辅酶A;由CtCNB1_0067编码的2，3-环氧苯甲酰辅酶A双羟化酶(BoxC)能够催化苯环水解开裂，使2，3-环氧苯甲酰辅酶A生成3，4-脱氢已二酰辅酶A半醛和甲酸;CtCNB1_0098编码的乙醛脱氢酶BoxD则可以把3，4-脱氢已二酰辅酶A半醛氧化为相应的酸酰辅酶A，3，4-脱氢已二酰辅酶A。通过以上结果证明了在CNB-1菌株中，苯甲酸是经由依赖于辅酶A的环氧化物途径进行好氧降解的。以该途径中的关键蛋白BoxB和BoxC为对象，对这种降解途径在已完成全测序的细菌基因组中的分布进行了调查，结果发现约有5％的细菌基因组编码有这种代谢途径，利用这种策略进行苯甲酸的好氧降解，表明自然界中一部分微生物采用依赖于辅酶A的环氧化物途径降解苯甲酸或者其它芳香化合物。在研究CNB-1菌株中苯甲酸降解的过程中发现，当该菌株以苯甲酸或3-羟基苯甲酸作为唯一碳源进行生长时，龙胆酸1，2-双加氧酶(GenA)被诱导表达。但在该菌株中，3-羟基苯甲酸是经由原儿茶酸途径进行降解;而苯甲酸的降解是通过依赖于辅酶A的环氧化物途径进行的。据此对CNB-1菌株中龙胆酸的代谢途径及其调控进行了研究。CNB-1菌株中的龙胆酸代谢基因簇（gen基因簇）是由结构基因genABC和两个编码调控蛋白的基因lysR-genR组成的。经过反转录RT-PCR分析，发现调控基因lysR-genR处于一个转录单元，结构基因genABC处于另外一个转录单元。通过qRT-PCR实验确认了MarR型的转录调控蛋白GenR在龙胆酸代谢基因簇的转录中发挥负调控的作用。与其它MarR型调控蛋白类似，纯化后的GenR蛋白在Native状态下以二聚体形式存在。利用引物延伸实验鉴定了genA的转录起始位点，并分析了genA的启动子区域。凝胶迁移实验(EMSA)确定了调控蛋白GenR可以与结构基因genA的上游序列PgenA特异性结合，通过DNaseⅠ足迹实验确认了其精确的DNA结合序列为一段41-nt的区域(ACGCATATCAACATTATGCTAATCATCAGTGTGCTGTTTAT)，这一DNA结合位点位于genA基因的转录起始位点上游，调控蛋白GenR与其结合可能阻碍RNA聚合酶与启动子序列的结合，从而阻止结构基因genABC的转录。通过凝胶迁移实验(EMSA)和表面等离子共振实验(SPR)对GenR蛋白的效应物进行了筛选，发现3-羟基苯甲酸、龙胆酸和苯甲酰辅酶A是GenR蛋白的效应物，可以解离GenR-PgenA复合物，从而解除GenR蛋白对genABC基因的转录抑制作用。此外，通过qRT-PCR对CNB-1菌株、突变株CNB-1Δ0097bcl和CNB-1ΔboxAB中genA和genR基因的转录水平变化进行分析，以及构建启动子-报告基因PgenA∷eGFP的质粒来观察苯甲酰辅酶A的作用，结果都清楚表明苯甲酰辅酶A可以在体内影响GenR蛋白与启动子PgenA的相互作用，从而调节龙胆酸代谢基因簇的转录。苯甲酰辅酶A在体外和体内影响GenR蛋白与启动子PgenA的相互作用的结果解释了为何CNB-1菌株以苯甲酸为碳源进行生长时能够诱导龙胆酸代谢基因簇中基因的表达:在CNB-1菌株中，苯甲酸被转化为苯甲酰辅酶A，而苯甲酰辅酶A可以解离GenR蛋白对genA基因的抑制，genA基因随后转录并合成龙胆酸1，2-双加氧酶，从而在细胞中检测到其酶活。许多MarR型调控蛋白的效应物都为芳香族辅酶A硫酯物，表明它们代表了MarR型调控蛋白一类新的效应物分子。