【摘 要】
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提高母猪繁殖性能是我国畜牧业发展的重要研究方向,卵泡的生长发育状态会直接影响卵巢组织的正常生理功能,而颗粒细胞作为卵泡中主要的体细胞,其雌二醇合成、增殖和凋亡会影响卵泡的生长发育和闭锁,因此探究调控颗粒细胞雌二醇合成、增殖和凋亡的影响因素至关重要。Micro RNA（miRNA）是由19-22个核苷酸（nt）组成的非编码RNA,能够与靶基因的3’UTR区互补配对从而抑制靶基因的转录或翻译,近年来很
【基金项目】
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国家自然科学基金（31802047）； 转基因生物新品种培育重大专项（2016ZX08006003）； 财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系；
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提高母猪繁殖性能是我国畜牧业发展的重要研究方向,卵泡的生长发育状态会直接影响卵巢组织的正常生理功能,而颗粒细胞作为卵泡中主要的体细胞,其雌二醇合成、增殖和凋亡会影响卵泡的生长发育和闭锁,因此探究调控颗粒细胞雌二醇合成、增殖和凋亡的影响因素至关重要。Micro RNA（miRNA）是由19-22个核苷酸（nt）组成的非编码RNA,能够与靶基因的3’UTR区互补配对从而抑制靶基因的转录或翻译,近年来很多研究已经表明miRNA对颗粒细胞具有调控作用。在高低产大白猪卵巢组织的测序文章中发现miR-184在高产母猪卵巢组织中的表达量显著高于低产母猪,并采集高低产大白×长白二元杂交母猪的卵巢组织进行试验验证,得到与前人一致的结果,并且miR-184在各物种间是高度保守的。因此,本研究以原代猪卵巢颗粒细胞为试验材料,旨在探究miR-184对猪卵巢颗粒细胞雌二醇合成、增殖和凋亡的调控作用。在本研究中,通过培养猪卵巢颗粒细胞并将miR-184的模拟物（miR-184 agomir）和拮抗剂（miR-184 antagomir）转染进细胞,通过RT-q PCR、Western Blot、ELISA、流式细胞术、Ed U染色、CCK-8、双荧光素酶报告试验等方法探究miR-184对猪卵巢颗粒细胞雌二醇合成、增殖凋亡的调控作用及分子机制。本研究主要获得以下结果:1.miR-184的表达特征分析通过比较miR-184在不同物种间的成熟序列,发现miR-184是高度保守的。检测miR-184在高低产大白×长白母猪卵巢组织的表达,发现其在高产仔数母猪卵巢组织中表达量更高;将miR-184的靶基因进行GO分析及KEGG分析,结果表明,miR-184可能参与到调控颗粒细胞生理功能的过程。2.miR-184通过靶定NR1D1促进颗粒细胞的雌二醇合成过表达miR-184促进颗粒细胞的雌二醇合成,并显著上调雌二醇合成关键基因Star、Cyp11a1、Cyp19a1 m RNA水平的表达;在蛋白水平上,过表达miR-184后,St AR有上调趋势,CYP11A1和CYP19A1明显上调;而干扰miR-184出现相反的结果。在颗粒细胞雌二醇合成过程中,miR-184的种子序列与NR1D1 3’UTR互补配对;过表达miR-184能够降低野生型NR1D1 3’UTR的荧光素酶活性,而对突变型没有影响;过表达miR-184会抑制NR1D1的m RNA及蛋白水平的表达,干扰miR-184得到相反的结果;在过表达miR-184的同时过表达NR1D1,会减弱miR-184对雌二醇合成的促进作用。3.miR-184通过靶定p21促进颗粒细胞的增殖过表达miR-184会促进颗粒细胞的增殖;并上调细胞周期相关基因Cyclin B、Cyclin D、Cyclin E和CDK4 m RNA和蛋白水平的表达;干扰miR-184则起到相反的作用。在颗粒细胞增殖过程中,miR-184的种子序列能够靶定p21 3’UTR区;过表达miR-184能够降低p21 3’UTR野生型荧光素的活性而对突变型没有影响;同时,过表达miR-184能够抑制p21 m RNA和蛋白的表达;而干扰miR-184会明显上调p21的转录和翻译;过表达p21会减弱miR-184对颗粒细胞增殖的促进作用。4.miR-184通过靶定HIPK2抑制颗粒细胞的凋亡过表达miR-184会在m RNA和蛋白水平上调抗凋亡基因BCL-2的表达,下调促凋亡基因BAX的表达;干扰miR-184会得到相反的结果,并且干扰miR-184显著上调早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例。在颗粒细胞凋亡过程中,miR-184的种子序列与HIPK2 3’UTR区互补配对;过表达miR-184降低野生型HIPK2 3’UTR的荧光活性而对突变型没有影响;过表达miR-184抑制HIPK2的转录和翻译;干扰miR-184促进其转录和翻译。综上所述,在猪卵巢颗粒细胞中,miR-184通过分别靶定NR1D1、p21及HIPK2从而促进颗粒细胞的雌二醇合成,促进细胞增殖并抑制细胞凋亡。
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