【研究背景】舒尼替尼（Sunitinib,SNT）是一种多靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitor,TKI）,是目前治疗转移性肾癌、胃肠道间质瘤等多种恶性肿瘤的一线靶向化疗药物之一。然而,基于SNT的化疗方案常伴随出现一系列严重的心血管不良反应,如高血压和心力衰竭等,导致患者心血管死亡风险显著增加。SNT化疗相关的心血管并发症成为限制其临床应用的主要原因,但由于SNT诱导心脏毒性的发生机制尚不明确,目前仍缺乏有效的临床干预手段。钠-葡萄糖共转运体2（Sodium-glucose co-transporter 2,SGLT2）抑制剂是一类新型降糖药物,恩格列净（Empagliflozin,EMPA）是其代表药物之一。多项大型临床研究证实,SGLT2抑制剂可以发挥独立于降糖机制外的心血管保护作用,显著降低糖尿病或非糖尿病心力衰竭患者的不良心血管事件发生率和心血管死亡风险,这使其成为慢性心力衰竭患者新的治疗选择。然而,对于接受SNT化疗后导致的心力衰竭患者人群,SGLT2抑制剂能否表现出心血管获益,尚无文献报道。本研究的主要目的是,探究SGLT2抑制剂EMPA对SNT心脏毒性的影响及分子机制,从而为SNT化疗相关的心血管损伤提供新的预防和治疗策略。第一部分舒尼替尼诱导的心脏毒性表现及其机制研究【目的】1.构建SNT诱导的心脏毒性小鼠模型,评估SNT对小鼠血压、心脏收缩舒张功能和冠脉微循环功能的影响。2.探究SNT导致心脏毒性的作用机制。【方法】1.将6~8周龄成年雄性C57BL/6J野生型小鼠随机分为:溶剂对照组和SNT组,分别给予对照溶剂（5%DMSO）或SNT（40 mg/kg/d）灌胃干预28天,构建SNT心脏毒性小鼠模型。通过无创血压测量系统、心脏超声和脉冲多普勒血流探测仪分别评估SNT对小鼠血压、心脏收缩舒张功能和冠脉微循环功能的影响。实验终点取材,通过ELISA检测血浆心肌损伤标志物含量,通过心脏组织病理切片染色和透射电镜（TEM）,评估SNT对小鼠心肌凋亡、心肌纤维化、氧化应激、微血管生成和心肌线粒体的影响。2.体外培养H9c2心肌细胞,使用不同浓度的SNT（1~20μM）处理细胞24 h、48 h或72 h,在细胞水平建立SNT毒性损伤模型。通过CCK-8细胞活力检测、Western Blot检测、双荧光标记的LC3腺病毒（Ad-m RFP-GFP-LC3）转染以及自噬调节药物应用,分别评估SNT对心肌细胞增殖和活力、凋亡、自噬及其相关通路的影响。【结果】1.SNT导致血压升高、心功能下降和冠脉微循环障碍。（1）与Vehicle组相比,SNT组小鼠的收缩压（SBP）、舒张压（DBP）和平均血压（MBP）显著升高。（2）与Vehicle组相比,SNT组小鼠的左室射血分数（LVEF）%、短轴缩短率（FS）%和二尖瓣血流E/A比值（E/A ratio）明显降低,二尖瓣血流E峰减速时间（DT）及等容舒张时间（IVRT）显著延长。（3）与Vehicle组相比,SNT组小鼠的冠脉血流储备（CFR）明显下降。2.SNT导致心肌线粒体损伤和心肌组织氧化应激增强。（1）与Vehicle组相比,SNT组小鼠心肌组织DHE红色荧光强度明显增强。（2）与Vehicle组相比,SNT组小鼠心肌内的损伤线粒体数量明显增加。3.SNT导致心肌细胞凋亡增加和生存活力下降。（1）SNT组小鼠血浆中心肌损伤标志物c Tn T和NT-pro BNP含量较Vehicle组明显升高。（2）SNT组小鼠心肌组织内TUNEL阳性细胞数量较Vehicle组明显增多。（3）与Control组相比,SNT以浓度和时间依赖性方式导致H9c2心肌细胞生存活力显著下降。（4）与Control组相比,SNT组H9c2心肌细胞的死亡数量明显增加。4.SNT导致心肌细胞自噬流阻断。（1）与Control组相比,SNT组心肌细胞内LC3-II/LC3-I的比值和P62蛋白表达量明显升高。（2）与Control组相比,SNT组心肌细胞内自噬小体数量明显增加,而自噬溶酶体数量无显著改变。（3）使用自噬激动剂Rapa预处理细胞后,心肌细胞活力较单独应用SNT干预时升高;而使用自噬抑制剂Baf A1预处理细胞后,心肌细胞活力较单独应用SNT干预时显著降低。5.SNT通过调控AMPK-m TOR信号通路影响心肌细胞自噬。与Control组相比,SNT组心肌细胞内p-AMPK/AMPK比值下调,而p-m TOR/m TOR比值上调。【结论】SNT通过调控AMPK-m TOR-自噬信号通路引起心肌细胞自噬功能紊乱,导致心脏毒性的产生。第二部分SGLT2抑制剂恩格列净对舒尼替尼心脏毒性的影响【目的】1.明确SGLT2抑制剂EMPA能否减轻SNT诱导的心脏毒性;2.探究SGLT2抑制剂EMPA对SNT心脏毒性的作用是否影响肿瘤自身生长及SNT的抗肿瘤疗效。【方法】1.C57BL/6J野生型小鼠分组及干预同第一部分。干预结束后,通过无创血压测量系统、心脏超声和脉冲多普勒血流探测仪检测,分别评估各组小鼠的血压、心脏收缩舒张功能和冠脉微循环功能。实验终点取材,通过ELISA检测血浆心肌损伤标志物含量,通过心肌组织病理切片DHE染色和透射电镜,评估各组小鼠的心脏氧化应激水平和心肌线粒体改变。2.体外培养人源肾细胞腺癌细胞（ACHN细胞）,使用不同浓度的SNT（1~20μM）或EMPA（10~1000 n M）分别处理ACHN细胞24 h、48 h及72 h,通过CCK-8法评估SNT或EMPA对肾癌细胞增殖和活力的影响。3.体外传代培养ACHN细胞,将其接种至5~6周龄M-NSG重度免疫缺陷小鼠皮下,构建人源肿瘤细胞系异种移植（CDX）小鼠模型,并随机分为:Control组、EMPA组、SNT组和SNT+EMPA组,分别给予对照溶剂（5%DMSO）、EMPA（10 mg/kg/d）、SNT（40 mg/kg/d）或SNT（40 mg/kg/d）联合EMPA（10 mg/kg/d）灌胃干预28天。观察干预过程中各组小鼠的体重和皮下肿瘤的体积变化。干预结束后,对各组小鼠行心脏彩超评估心脏功能。实验终点取材,测量并记录各组小鼠皮下肿瘤的重量。【结果】1.EMPA能够在不影响体重及血糖的情况下,明显减轻SNT诱导的心脏毒性。（1）小鼠的体重及血糖变化在各组间无统计学差异。（2）与Control组相比,SNT组小鼠的各项血压指标随干预时间延长逐渐升高;SNT+EMPA组小鼠的SBP、DBP及MBP较SNT组均出现显著下降。（3）与Control组相比,SNT组小鼠LVEF%、FS%、MV E/A ratio和CFR降低,DT和IVRT显著延长;与SNT组相比,SNT+EMPA组小鼠LVEF%、FS%、E/A ratio及CFR显著回升,DT和IVRT明显缩短。2.EMPA能够减轻SNT导致的心肌损伤。SNT组小鼠的血浆c Tn T和NT-pro BNP较Control组明显升高;而SNT+EMPA组小鼠的血浆c Tn T和NT-pro BNP较SNT组显著下降。3.EMPA能够减轻SNT导致的心脏氧化应激增强和心肌线粒体损伤。（1）SNT组小鼠心肌组织DHE红色荧光强度较Control组明显增强;而SNT+EMPA组小鼠心肌组织DHE红色荧光强度较SNT组显著降低。（2）与Control组相比,SNT组小鼠心肌内损伤线粒体的数量明显增多;与SNT组相比,SNT+EMPA组小鼠心肌内的损伤线粒体数量明显减少。4.EMPA的心血管保护作用不影响肿瘤生长和SNT抗肿瘤疗效。（1）SNT以浓度和时间依赖性方式引起ACHN细胞生存活力显著下降;EMPA对ACHN细胞生存活力无明显影响。（2）EMPA组小鼠的肿瘤体积变化较Control组无明显差异,而SNT组小鼠肿瘤体积的增长速度明显减慢;肿瘤体积变化在SNT组与SNT+EMPA组间无明显差异。（3）与Control组相比,EMPA组小鼠肿瘤重量无统计学差异,SNT组小鼠肿瘤重量明显下降;肿瘤重量在SNT组与SNT+EMPA组间无明显差异。（4）与Control组相比,EMPA组小鼠的各项心脏超声指标无统计学差异,SNT组小鼠的LVEF%、FS%和MV E/A ratio明显降低;与SNT组相比,SNT+EMPA组小鼠的LVEF%、FS%和MV E/A ratio显著回升。【结论】EMPA能够减轻SNT诱导的心脏毒性,且EMPA的这种心脏保护作用不引起体重和血糖的改变,对肿瘤本身的生长和SNT的抗肿瘤疗效也无明显影响。第三部分SGLT2抑制剂恩格列净减轻舒尼替尼心脏毒性的机制研究【目的】探究SGLT2抑制剂EMPA减轻舒尼替尼心脏毒性的分子机制。【方法】1.动物分组及干预同第一部分。实验终点取材,通过Western Blot检测各组小鼠心肌细胞凋亡及自噬相关通路蛋白的表达水平,通过心脏病理切片TUNEL染色评价各组小鼠心肌细胞凋亡情况。2.体外培养H9c2心肌细胞,使用SNT（5μM）或SNT（5μM）联合不同浓度EMPA（50~1000 n M）处理细胞48 h。通过CCK-8法、Hoechst 33258染色或TUNEL染色细胞评估心肌细胞增殖和活力及细胞凋亡情况。通过WesternBlot检测不同干预组细胞凋亡及自噬相关通路蛋白的表达水平。使用Ad-m RFP-GFP-LC3转染和共聚焦显微镜观察不同干预对心肌自噬流的影响。使用AMPK抑制剂（Compound C,CC）或自噬抑制剂巴弗洛霉素A1（Baf A1）探究AMPK-m TOR-自噬信号通路在EMPA减轻SNT心脏毒性机制中的作用。【结果】1.无论是在整体动物还是细胞水平,EMPA都能够减轻SNT诱导的心肌损伤。（1）SNT导致小鼠心肌组织内TUNEL阳性细胞的数量明显增多;而SNT+EMPA组小鼠心肌组织内TUNEL阳性细胞的数量较SNT组显著下降。（2）SNT导致心肌细胞生存活力明显下降;而SNT+EMPA组心肌细胞生存活力较SNT组显著提高。（3）SNT导致凋亡细胞数量显著增多;而SNT+EMPA组凋亡细胞数量较SNT组明显减少。2.EMPA能够解除SNT对心肌细胞自噬流的阻断作用,改善心肌自噬功能。（1）无论是心肌组织还是心肌细胞,SNT组LC3-II/LC3-I的比值和P62蛋白的表达量较Control组均明显升高;而SNT+EMPA组LC3-II/LC3-I的比值和P62蛋白的表达量较SNT组均显著下调。（2）SNT导致心肌细胞内自噬小体数量明显增加,而对自噬溶酶体数量无明显影响;与SNT组相比,SNT+EMPA组心肌细胞内自噬小体数量显著下降,同时自噬溶酶体数量增多。（3）Baf A1+SNT两药干预与SNT单药干预相比,细胞内LC3-II/LC3-I的比和P62蛋白的表达量在两组间无明显差异;Baf A1+SNT+EMPA三药干预与SNT+EMPA两药干预相比,细胞内LC3-II/LC3-I比值和P62蛋白表达量在两组间也无明显差异。3.EMPA能够恢复SNT诱导的AMPK-m TOR信号通路失衡。无论是心肌组织还是心肌细胞,与Control组相比,SNT均能够引起p-AMPK/AMPK比值的下调和p-m TOR/m TOR比值的上调;与SNT组相比,SNT+EMPA组p-AMPK/AMPK比值升高,同时p-m TOR/m TOR比值下降。4.抑制AMPK或抑制自噬,可阻断EMPA对SNT心肌细胞损伤的保护作用。（1）CC或Baf A1预处理细胞后,SNT+EMPA联合干预与SNT单药干预相比,心肌细胞死亡率和细胞活力在两组间无明显差异。（2）CC或Baf A1预处理细胞后,SNT+EMPA联合干预与SNT单药干预相比,细胞内自噬标志蛋白和AMPK-m TOR通路蛋白变化在两组间无明显差异。【结论】EMPA通过调控AMPK-m TOR-自噬信号通路改善心肌细胞的自噬功能,进而减轻SNT诱导的心脏毒性。