研究背景及目的:慢性疼痛是一个常见的公共健康问题,不仅造成巨大的社会经济负担,而且还增加了患者失眠、抑郁、自杀等心理疾病发生率。然而,慢性疼痛的发病机制仍存在争议,导致缺乏有效的治疗手段。中枢神经炎症一直被认为是影响疼痛慢性化进程的重要因素,而小胶质细胞作为中枢神经系统重要的免疫细胞,是中枢神经炎症最直接的发起者。细胞焦亡作为免疫细胞对抗外界病原体的重要防御手段,过度的细胞焦亡将放大炎症反应,促进疾病的病程。自噬作为细胞保守的生物学过程,可以通过降解错误折叠的蛋白质、细胞器等有害物质,抑制免疫炎症反应。虽然已有研究报道细胞自噬可以抑制细胞焦亡,促进炎症消退,缓解炎症反应。但是,细胞焦亡是否参与慢性炎性疼痛仍无报道,同时在慢性炎性疼痛中细胞自噬与细胞焦亡相互作用机制也未明确。干细胞疗法是过去几十年医学界研究热点,其组织修复、再生、抗炎作用得到了广泛研究,对慢性疼痛的治疗也取得了乐观的效果。但是其伴随免疫排斥、成瘤性等安全问题一直被诟病。近年来随着干细胞外泌体的出现,其治疗中枢退行性疾病、器官保护、组织再生、抑制炎症的生物学功能已得到了大量研究证实,使用的安全性和便捷性使其大有取代母体干细胞的趋势。为此本课题希望进一步研究人脐带间充质干细胞外泌体（Human umbilical cord mesenchymal cell-derived exosomes,huc-MSC-EXO）治疗慢性炎性疼痛的效应及相关机制。研究方法:1、细胞自噬及焦亡对慢性炎性疼痛病程的影响1)慢性炎性疼痛模型构建及药物干预:通过小鼠左侧后足皮下注射完全弗氏佐剂（CFA）20μL或生理盐水20μL,分别为实验组和对照组。MCC950（Matthew Cooper compound 950）组:腹腔注射10mg/kg的MCC950,双硫仑（Disu）组:腹腔注射20mg/kg和40mg/kg的Disu。3-MA组:造模前1小时鞘内注射5μg/5μl的3-MA;RAP组:造模前1小时鞘内注射5μg/5μl的雷帕霉素（RAP）。2)行为学检测:通过电子Von Frey纤维针和哈格里夫斯辐射热仪分别检测假手术组（sham）、实验组（1天、3天、7天）、不同药物组的机械痛和热痛阈值。3)免疫荧光:对sham组及造模后1天、3天、7天脊髓腰膨大进行小胶质细胞marker蛋白iba1免疫荧光染色,观察小胶质细胞激活增殖变化。造模后第3天,通过免疫荧光将焦亡相关分子GSDMD和caspase-1-p20分别与iba1、星形胶质细胞marker（GFAP）、神经元marker（Neu N）双染。造模后第1天取脊髓腰膨大,将自噬相关分子LC3和P62分别与iba1、GFAP、Neu N进行双染。4)实时定量聚合酶链反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）:取sham组、造模后1天、3天、7天脊髓组织,RT-q PCR检测IL-1β、IL-18的变化。5)免疫印迹（Western blot,WB）:提取各实验组左侧脊髓背角蛋白,检测sham组、造模后1天、3天、7天及不同药物干预组iba1、NLRP3、GSDMD-F、GSDMD-N、caspase1-p20、ASC、IL-1β、LC3、beclin1、P62等蛋白的表达变化。2、Huc-MSC-EXO通过调控细胞自噬和焦亡缓解慢性炎性疼痛1)huc-MSC-EXO分离获取及鉴定:体外批量扩增培养人脐带间充质干细胞,收集细胞培养上清,超速离心机分离获取外泌体;对获取的外泌体进行标准化鉴定,方法为WB检测外泌体膜蛋白CD9、TSG101,透射电镜观察外泌体形态,Nanosight检测外泌体颗粒直径。2)huc-MSC-EXO鞘内注射及效应评估:自造模前1小时至造模后第3天连续鞘内注射20μg/20μl的huc-MSC-EXO,检测造模前、造模后1天、3天、7天疼痛行为学的变化,HE检测造模后第3天后足水肿及炎症反应。WB检测造模后第3天左侧脊髓背角iba1表达变化,检测NLRP3、GSDMD-F、GSDMD-N、caspase1-p20、ASC、IL-1β、LC3、beclin1、P62等蛋白的表达变化。3)huc-MSC-EXO影响慢性炎性疼痛中miR-146a-5p/TRAF6的表达:分析huc-MSC-EXO测序数据集GSE159814和GSE69909,筛选富集miRNA,利用miRWalk、miRBD、Target Scan、ENCORI预测候选靶基因。RT-q PCR检测造模前和造模后1天、3天、7天miR-146a-5p的表达变化,鞘内注射huc-MSC-EXO后第3天再次检测miR-146a-5p的表达变化。WB检测TRAF6的表达变化,造模后第3天将TRAF6和GFAP、iba1免疫荧光共染。3、Huc-MSC-EXO通过miR-146a-5p/TRAF6影响BV2细胞自噬和细胞焦亡1)诱导小胶质细胞焦亡及自噬改变:以LPS刺激24小时和ATP刺激30分钟为诱导方案,WB检测NC组（PBS）、Con组（LPS+ATP）、MCC950组、Disu组NLRP3、GSDMD、caspase1-p20、ASC、LC3、beclin1、P62等分子表达变化,Elisa检测细胞上清中IL-1β含量变化。2)Huc-MSC-EXO预处理对BV2细胞焦亡和自噬的影响:首先将PKH-26染料标记的huc-MSC-EXO与BV2细胞共孵育,激光共聚焦显微镜观察BV2细胞体外摄取huc-MSC-EXO情况;CCK8检测不同浓度huc-MSC-EXO对BV2细胞增殖活力的影响;WB检测NC组（PBS）、Con组（LPS+ATP）、huc-MSC-EXO组NLRP3、GSDMD、caspase1-p20、ASC、LC3、beclin1、P62等分子表达变化,Elisa检测上述各组细胞上清中IL-1β、IL-18含量变化;通过Yo-Pro-1染料观察各实验组细胞焦亡的发生情况,通过透射电镜观察huc-MSC-EXO对BV2细胞自噬小体产生的影响。3)Huc-MSC-EXO通过miR-146a-5p/TRAF6促进BV2自噬,抑制BV2细胞焦亡:通过对人脐带间充质干细胞转染miR-146a-5p mimic和inhibitor,收集细胞上清获取相应外泌体,WB检测LPS+ATP组、miR-146a-5p mimic Exos组、miR-146a-5p mimic-NC Exos组、miR-146a-5p inhibitor Exos组、miR-146a-5p inhibitor-NC Exos组对BV2细胞TRAF6、NLRP3、GSDMD、ASC、caspase1-p20蛋白表达的影响,以及LC3、beclin1、P62蛋白表达变化;使用si RNA对BV2细胞进行TRAF6干扰敲低,WB检测TRAF6、NLRP3、GSDMD、ASC、caspase1-p20及LC3、P62蛋白表达变化。研究结果:1、CFA诱导慢性炎性疼痛后机械痛和热痛阈值持续降低,至少持续至术后第7天,iba1蛋白表达水平逐渐升高,免疫荧光提示小胶质细胞增殖活化;WB检测提示造模后左侧脊髓背角NLRP3、GSDMD-F、GSDMD-N、caspase1-p20、IL-1β蛋白表达显著增加,免疫荧光结果提示GSDMD、caspase1-p20与iba1、Neu N共染;MCC950和Disu降低了左侧脊髓背角GSDMD-N、caspase1-p20、ASC蛋白表达,40mg/kg的Disu显著提高了慢性炎性疼痛的机械痛、热痛阈值;2、WB检测提示造模后第1天、3天、7天左侧脊髓背角自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、beclin1、P62表达上调,免疫荧光结果提示LC3、P62与iba1、Neu N共染;鞘内注射3-MA降低了慢性炎性疼痛的机械痛、热痛阈值,而RAP提高了慢性炎性疼痛的机械痛、热痛阈值,WB结果提示3-MA组NLRP3、GSDMD-F、GSDMD-N、caspase1-p20蛋白表达增多,RAP组上述蛋白表达降低;3、鞘内注射huc-MSC-EXO提高了慢性炎性疼痛的机械痛、热痛阈值,缓解了左侧后足的水肿及炎症反应,降低了iba1蛋白表达,抑制了脊髓背角小胶质细胞增殖;与对照组相比,huc-MSC-EXO显著抑制NLRP3、GSDMD-F、GSDMD-N、caspase1-p20等焦亡相关蛋白表达,同时促进了LC3-Ⅱ、beclin1表达,抑制了P62表达;huc-MSC-EXO进一步提高了脊髓背角miR-146a-5p的表达,抑制了靶基因TRAF6的蛋白表达水平;造模后1天、3天、7天TRAF6蛋白表达逐渐升高,免疫荧光提示TRAF6与iba1共染;4、LPS刺激24小时和ATP刺激30分钟诱导了BV2细胞NLRP3、GSDMD-F、GSDMD-N、caspase1-p20等细胞焦亡相关蛋白表达增加,而100μg/ml的huc-MSC-EXO预处理后显著抑制NLRP3、GSDMD-F、GSDMD-N蛋白表达,同样减少了BV2细胞对Yo-Pro-1染料的摄取;LPS刺激24小时和ATP刺激30分钟诱导了BV2细胞LC3-Ⅱ表达下降,P62表达上调,100μg/ml的huc-MSC-EXO预处理后LC3-Ⅱ表达增加,P62表达减少,同时透射电镜发现huc-MSC-EXO促进了自噬小体产生;通过3-MA预处理BV2细胞,huc-MSC-EXO对细胞焦亡的抑制作用被削弱;miR-146a-5p mimic Exos组显著抑制了TRAF6、NLRP3、GSDMD-F、GSDMD-N等相关分子表达,提高了LC3-Ⅱ表达,抑制了P62表达;miR-146a-5p inhibitor Exos组显著提高了TRAF6、NLRP3、GSDMD-F、GSDMD-N等相关分子表达,降低了LC3-Ⅱ表达,提高了P62表达;si RNA干扰敲低TRAF6后,TRAF6、NLRP3、GSDMD-F、GSDMD-N等相关分子表达降低,LC3-Ⅱ表达增多,P62表达降低。研究结论:Huc-MSC-EXO通过miR-146a-5p/TRAF6分子通路促进小胶质细胞自噬,从而抑制小胶质细胞焦亡,最终缓解慢性炎性疼痛。