第一部分静脉循环障碍对大鼠局灶性脑梗死的影响背景与目的:脑静脉发育异常在人群中普遍存在,正常生理状态下,静脉发育异常一般不引起临床症状,但在病理情况下,发育异常的脑静脉可能导致血流动力学变化,并对存在的神经系统病理状态产生影响。基础研究表明永久性阻断双侧颈外静脉血流会导致短暂的颅内压力升高,但对长期的病理改变尚不清楚。急性缺血性卒中时,完全阻断脑静脉引流可能会导致脑梗死面积扩大。临床研究也发现,颅内静脉引流不对称可能可以预测缺血性卒中的预后,但具体机制尚不清楚。本研究通过建立脑静脉循环障碍合并局灶性脑梗死的SD大鼠模型,目的在于观察静脉循环障碍对大鼠局灶性脑梗死的影响,并初步探讨可能的机制。方法:328只成年雄性SD大鼠随机分为4组:假手术组（Sham）、颈外静脉闭塞组（EJVO）、大脑中动脉闭塞组（MCAO）及颈外静脉闭塞合并大脑中动脉闭塞组（EJVO+MCAO）。采用TTC染色的方法评估脑梗死面积,时间点选择为术后1d及3d。双前肢抓力测试、平衡木试验、除胶试验用于评估各组大鼠的神经功能,时间点选择为术前、术后1d、3d、7d和14d。用3D ASL磁共振动态监测各组大鼠的脑血流值,时间点选择为术前、术后即刻、3d、7d和14d。静脉注射伊文斯蓝用于评估血脑屏障的渗透性,干湿重法测量脑组织含水量以评估脑水肿程度。免疫荧光染色和Western Blot检测脑组织Neu N,CD31,PDGFRβ,Desmin,ZO-1,Occludin等蛋白的表达水平,以评估神经元损伤、血管新生及血脑屏障完整性等。结果:1.TTC染色结果显示,单纯的双侧颈外静脉闭塞不引起脑梗死,大脑中动脉闭塞会导致脑梗死。与单纯MCAO组相比,EJVO+MCAO组大鼠的梗死体积在术后1d天及第3d均明显增大。2.ASL结果显示,Sham组的CBF值在基线及术后14d内基本保持一致。EJVO组术后即刻CBF值较基线稍有下降,第3d后恢复正常。MCAO组和EJVO+MCAO组大鼠的CBF均较术前有显著下降,EJVO+MCAO组下降较MCAO组更多。3.Sham组和EJVO组在术后不引起大鼠前肢抓力、平衡木试验、除胶试验等运动及感觉功能的下降。MCAO组和EJVO+MCAO组大鼠均在术后第1d即出现显著的神经功能下降,此后有逐渐恢复的趋势。MCAO组大鼠的平衡木试验在术后7d、胶带清除时间在术后第14d时恢复到术前水平。EJVO+MCAO组的大鼠平衡木试验在术后14d时恢复到术前水平,而胶带清除试验在观察期内始终未恢复正常。EJVO+MCAO组大鼠的神经功能下降较MCAO组更严重。4.Sham组和EJVO组大鼠在术后不出现明显的伊文斯蓝渗出,MCAO组和EJVO+MCAO均出现明显的伊文斯蓝渗出,以术后第3d渗出最为严重,其中MCAO组在术后第14d恢复正常,而EJVO+MCAO组在14d仍未恢复到正常水平。与MCAO组相比,EJVO+MCAO组大鼠伊文斯蓝渗出显著增多。通过干湿重法评估脑水肿程度,结果提示EJVO组在术后第1d出现轻微的脑水肿,3d后恢复到正常。MCAO组和EJVO+MCAO组均在术后出现脑水肿,与MCAO组相比,EJVO+MCAO组脑水肿程度更重,持续时间更长。5.HE染色与尼氏染色结果提示,与Sham组相比,EJVO不会导致神经元形态改变和尼氏小体减少,不导致神经元损伤;但MCAO和EJVO+MCAO组均导致明显的神经元损伤,HE染色神经元排列紊乱、核膜皱缩或破裂,核仁消失,细胞与组织界限不清,尼氏染色暗神经元增更多,尼氏小体减少;EJVO+MCAO的神经元损伤较MCAO组更为严重。免疫荧光结果提示,与Sham组相比,EJVO不会造成Neu N阳性细胞数下降,MCAO和EJVO+MCAO组出现显著的神经元数量下降,EJVO+MCAO组大鼠的神经元数量下降较MCAO组更为严重,差异在术后3d开始有统计学意义。Western Blot结果提示,Nue N蛋白水平在Sham组和EJVO组相仿,MCAO与EJVO+MCAO组均出现显著的Neu N蛋白水平下降。与MCAO组相比,EJVO+MCAO组Neu N水平下降更为严重。6.免疫荧光结果显示,与Sham组相比,EJVO组的微血管覆盖率无明显降低,Western Blot结果也提示EJVO组CD31蛋白水平与Sham组相仿,EJVO不引起CD31水平下降。MCAO组CD31免疫荧光和Western Blot结果均提示在术后第1d较Sham组显著降低,第3d恢复正常,在第14d时则出现较Sham显著增高。EJVO+MCAO组也在术后出现明显的CD31水平降低。与MCAO组相比,EJVO+MCAO组CD31水平下降更多。7.免疫荧光和Western Blot结果提示,EJVO不引起PDGFRβ和Desmin水平的下降。MCAO和EJVO+MCAO组在术后第1d均出现明显的PDGFRβ和Desmin蛋白表达的下降。MCAO组在术后3d的PDGFRβ、Desmin水平均较Sham组有明显升高,提示周细胞增生。EJVO+MCAO组在术后第7d出现明显的周细胞增生。与MCAO组相比,EJVO+MCAO组周细胞增生延缓、增生程度低。8.免疫荧光和Western Blot结果提示,EJVO不引起ZO-1和Occludin表达降低。免疫荧光和Western Blot结果均提示MCAO和EJVO+MCAO组大鼠的ZO-1和Occludin表达较Sham组降低,在术后第3d达最低水平,其中MCAO组的ZO-1和Occludin表达在术后第7d恢复到Sham组水平,而EJVO+MCAO组在14d内持续低表达。与MCAO组相比,EJVO+MCAO组的ZO-1和Occludin表达更低。结论:静脉循环障碍可能通过阻碍血管新生、延缓脑血流恢复、加剧血脑屏障结构和功能的损伤,从而加重大鼠脑梗死的严重程度。第二部分丁苯酞对伴有静脉循环障碍的局灶性脑梗死大鼠的保护作用背景与目的:静脉发育异常在人群中普遍存在,并对神经系统疾病的发生发展产生一定的影响。但由于缺血性卒中的病因在动脉,目前关于缺血性卒中的研究及干预主要是针对动脉和神经元的保护,对静脉循环可能造成的影响不够重视,也没有针对性的治疗。既往研究发现,丁苯酞可以从改善微循环、保护线粒体、抗血小板聚集、抗氧化应激、抗炎等多方面对缺血性卒中的治疗发挥作用。但对于合并静脉引流障碍的缺血性卒中患者,丁苯酞是否同样有效目前尚不清楚。第一部分研究我们已证实脑静脉引流障碍将加重大鼠大脑中动脉闭塞后的脑梗死严重程度,但目前的临床和基础研究均未有关于伴有静脉循环障碍的急性缺血性卒中针对性治疗。在本部分研究中,我们将临床常用药丁苯酞应用于伴有静脉循环障碍的局灶性脑梗死大鼠,观察其疗效,并初步探讨可能的机制。方法:174只SD雄性大鼠随机分成2组:丁苯酞治疗组和生理盐水对照组,两组大鼠均接受双侧颈外静脉闭塞及大脑中动脉闭塞手术。丁苯酞治疗组在术后连续用药7d,剂量为5mg/kg/d。对两组大鼠的脑梗死体积、脑血流量、颈外静脉压力、神经功能评分、伊文斯蓝渗出量和脑水肿程度等进行评估,并用免疫荧光和Western Blot方法检测Neu N、CD31,PDGFRβ,Desmin,ZO-1,Occludin等表达水平,以评估神经元损伤、血管新生及血脑屏障完整性等。结果:1.与非治疗组相比,丁苯酞治疗3d可以减小伴静脉循环障碍的MCAO大鼠的梗死面积。2.丁苯酞治疗组可以显著改善EJVO后MCAO大鼠的颈外静脉压力,两组间比较从术后6h开始有统计学差异。丁苯酞治疗组大鼠颈静脉压力在术后12h即恢复到正常,而非治疗组大鼠在术后3d仍未恢复到正常水平。3.与非治疗组相比,丁苯酞治疗3d对可以显著改善缺血区皮层的脑血流值,治疗组大鼠的CBF在术后14d恢复到基线水平,而非治疗组14d仍未恢复正常。4.两组大鼠术后的运动和感觉功能均明显下降。与非治疗组相比,丁苯酞治疗可以改善大鼠的前肢抓力,促进平衡木试验及除胶试验较早恢复。5.丁苯酞治疗3d后可以显著减少伊文斯蓝渗出,减轻脑水肿程度,保护血脑屏障。6.HE染色结果显示,与治疗组相比,非治疗组大鼠的神经元细胞核破裂更早、核质分界不清,核仁不清晰,神经元损伤更严重。尼氏染色发现丁苯酞治疗组大鼠的尼氏染色阳性细胞数较非治疗组多,晚期仍可见部分结构正常的神经元细胞,对照组均为无细胞核结构的暗神经元,提示为缺血损伤的神经元细胞。免疫荧光和Western Blot分别标记Neu N阳性细胞数及蛋白水平,结果提示丁苯酞治疗可以增加梗死区Nue N阳性细胞数量,提高Neu N蛋白水平。7.免疫荧光和Western Blot结果提示,与非治疗组相比,丁苯酞治疗从术后第3d开始可以显著提高CD31的覆盖率和蛋白水平,具有明显的促血管内皮细胞增生的作用。8.与非治疗组相比,丁苯酞治疗在术后第1d即提高Desmin表达、术后第3d开始发挥促PDGFRβ表达的作用。丁苯酞治疗3d后可以显著增加Occludin蛋白的表达,治疗7d后显著增加ZO-1蛋白水平,促进血脑屏障结构完整性的修复。结论:丁苯酞治疗对伴静脉循环障碍的大脑中动脉闭塞大鼠有保护作用,其机制可能是通过改善受阻的静脉循环、促进血管新生、恢复缺血区血供,并促进周细胞增生、上调紧密连接蛋白水平以维持血脑屏障完整性相关。