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单纯疱疹病毒性角膜炎(Herpes Simplex Keratitis,HSK)是由单纯疱疹病毒(HSV)感染引起的一种常见眼角膜疾病,主要由HISV-1型引起,它病情迁延、易复发,终身不愈,是角膜病中首要的致盲原因。目前其主要的治疗方法为全身及局部抗病毒治疗,能使病情得到不同程度的控制,但远没有达到根治及控制传播;并且长期服药存在副反应及药物耐受等问题。国内外许多学者均认为,诱导针对病毒的特异性免疫是最终控制HSK的最有效途径,因此抗HSK疫苗的研制是当今重要的研究方向。
HSV-1是具有包膜的病毒,包膜上含有多种糖蛋白,都具有不同的免疫原性,其中以糖蛋白D(gD)和糖蛋白B(gB)尤为重要,它们是HSV-1主要的免疫原。
多年来,针对HSK的疫苗研究取得了一些成果,很多疫苗应用到动物体内,起到一定的效果,但到目前为止,尚无有效疫苗应用到临床。DNA疫苗被认为是疫苗研制的革新,这种疫苗接种后,DNA靶基因编码的蛋白抗原在宿主细胞内表达,其加工处理过程与病毒感染的自然过程相似,抗原提呈过程也相同,从而以自然的形式被加工后以天然构象提呈给宿主的免疫识别系统,激发较强的细胞及体液免疫应答。
设计合适的疫苗佐剂以进一步增强DNA疫苗的免疫原性从而提高免疫效应,将对该类疫苗的研制与实际应用起着十分重要的作用。细胞因子分子佐剂是近来倍受关注的一种疫苗佐剂。白细胞介素21(IL-21)是近几年新发现的一种细胞因子,它是一种较强的免疫增强因子,具有多重生物学效应。在非特异性免疫应答方面,IL-21可促进NK细胞分化并表达CD16分子,从而使之具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)作用;在体液免疫方面,IL-21能协同活化B细胞;在细胞免疫方面,IL-21可增强抗原特异性T细胞的细胞毒活性。
DNA疫苗的接种途径同样影响疫苗的免疫效果。眼表面和其它粘膜组织一样具有粘膜相关淋巴组织(MALT),它构成了眼表粘膜免疫系统(OMIS),具有局部摄取外来抗原,刺激B细胞、T细胞增殖,在眼表局部产生特异性细胞及体液免疫反应,如分泌高效slgA等。HSK正是一种眼表粘膜感染性疾病,对于这一类疾病,采取眼表粘膜接种DNA疫苗,相对于全身系统接种而言,可以在眼局部产生较强的细胞及体液免疫。
对于DNA疫苗的粘膜接种,如何提高它在粘膜表面的停留时间、对粘膜的渗透性、对细胞的转染效率以及减少DNA的降解是至关重要的,尤其对于眼表面粘膜:因眼有不断的瞬目动作,从而清除停留在眼表粘膜的物质。解决此问题最好的办法是增加合适的DNA疫苗载体输送系统。纳米基因载体是近些年发展的新型基因载体,它具有无免疫原性、能提高疫苗的吸收度及生物利用度,减少DNA的降解以及毒副作用低等突出优点,并且尤其能提高局部粘膜免疫水平。
据此,本研究选择gD作为疫苗的主要免疫原,IL-21作为新型细胞因子疫苗分子佐剂,采用经典基因克隆方法,构建了DNA疫苗质粒pRSC-gD-IL-21,经酶切、测序、RT-PCR真核细胞目的基因转录表达以及Western Blot目的蛋白表达鉴定后,结果证明构建成功;并将其免疫小鼠,相对于对照疫苗pRSC-gD等,诱导了明显较强的小鼠抗病毒特异性的细胞、体液免疫应答以及非特异性的NK细胞杀伤活性;同时,在HSK小鼠模型研究中,疫苗pRSC-gD免疫鼠HSK的病情虽亦有所缓解,但疫苗pRSC-gD-IL-21免疫鼠HSK的病情程度及持续时间明显轻于前者。上述结果表明IL-21增强了疫苗抗病毒的细胞免疫、体液免疫以及非特异性固有免疫,是一种良好的新型抗病毒DNA疫苗分子佐剂。
其次,我们比较了肌肉系统接种与眼表粘膜接种(局部滴眼)该实验疫苗的免疫原性,动物实验结果表明,后者诱导了与前者相近的系统细胞及体液免疫,但所诱导的眼表粘膜免疫应答(sIgA),后者明显强于前者;在进一步的病毒攻击实验中,眼表粘膜接种组的HSK病变亦明显轻于肌肉系统接种组。
最后,本研究最终采用眼表粘膜接种(局部滴眼)方式接种纳米复合物PEI-Fe3O4为载体的DNA疫苗pRSC-gD-IL-21,其疫苗目的基因编码的蛋白在鼠体眼角膜活体表达的量及强度均明显强于单纯DNA疫苗pRSC-gD-IL-21;小鼠动物免疫结果亦显示,纳米复合物实验疫苗所诱导的系统细胞、体液免疫、局部粘膜免疫以及非特异性固有免疫,都明显强于单纯pRSC-gD-IL-21等各对照疫苗;更主要的是,在HSK动物模型中,其能较有效地抵抗HSV-1眼部感染,从而使预防HSK的效应大大强于其它各对照组。
上述研究表明:眼表粘膜接种(局部滴眼)纳米复合物PEI-Fe3O4为载体的DNA疫苗pRSC-gD-IL-21在小鼠HSK动物模型中显示出明显较强的特异性的粘膜免疫应答,以及系统细胞免疫和体液免疫,并明显抵抗了HSV-1的眼部感染及减轻了HSK的发生、发展,为今后此疫苗进一步的临床试验研究奠定了基础。