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背景作为体液免疫的一部分,B细胞在机体适应性免疫调节中具有重要作用,机体产生的抗体(Antibody,Ab)在感染性疾病、肿瘤、自身免疫病和移植排斥中扮演重要角色。抗体是由B细胞分化、发育而来的浆细胞所分泌的。B细胞的分化发育和活化过程受许多信号通路的调节,例如 PI3K(Phosphoinositide 3-kiase)信号通路,NF-κB((Nuclearfactor of kappa B)信号通路,BCR(B-cell receptor)信号通路和Notch信号通路,其中Notch信号通路在B细胞中的功能是当前的研究热点之一。早在1917年,遗传学家Thomas Hunt Morgan和他的同事在具有残缺翅膀表型的果蝇中首次描述了 Notch基因,Notch受体是一类高度保守的跨膜蛋白,在结构上分为胞外区(NEC),跨膜区(NTM)和胞内域(NICD),哺乳类动物Notch受体家族有四个成员,分别为Notch1-4,可与五个配体相结合(Delta-like1,3,4和Jagged1,2),Notch信号通路的激活起始于邻近细胞表面的配体-受体相互作用,进而影响目的基因的转录。目前研究已证实,作为Notch家族中的重要一员,Notch1对小鼠T细胞的分化发育极其重要,例如,在小鼠骨髓中Notch1基因缺失后,胸腺中T细胞发育受阻,并伴随产生大量的异位B细胞。Notch信号通路可促进边缘区淋巴细胞(marginal zone,MZ)的发育,并且对B细胞分化发育的晚期阶段非常重要。另有研究发现,Notch1的配体在B细胞的活化过程中也发挥重要作用。这些研究表明:Notch1可能对浆细胞和抗体的产生具有重要的作用。因此,本课题研究的主要内容为Notch1对B细胞的分化发育及抗体的产生的影响。研究目的探讨Notch1及其配体对B细胞产生抗体是否有影响。研究方法1)研究Notch1在小鼠B细胞活化过程中的表达情况。分离小鼠脾脏细胞,用LPS体外诱导使活化,用流式细胞术(Fluorescence activated cell sorting,FACS)检测在B细胞活化过程中Notch1的表达情况;2)获得B细胞特异性敲除Notch1基因的模型小鼠。用Notch1 flox/flox(Notch1f/f)基因型小鼠和CD19cre基因型小鼠进行杂交,得到三种基因型小鼠:Notch1f/f、CD19cre Notch1f/+和 CD19creNotch1f/f。3)用蛋白质免疫印迹(Western blotting)的方法检测小鼠脾脏中Notch1及其配体D1l1和Jag1的蛋白表达水平。4)用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)检测 B 细胞特异性敲除Notchl后,用LPS体外刺激B细胞活化,与对照组相比,抗体的产生是否受影响。5)在对照组和B细胞特异性敲除Notch1基因组小鼠,用皮下注射125mg髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein,MOG)35-55 肽段模拟表位的方法诱导小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)模型,用ELISA方法检测小鼠外周血血清中抗体的分泌水平是否有变化。研究结果1)Notch1主要在CD19hi的B细胞表面高表达,在用LPS刺激B细胞活化过程中,刺激培养第1天时Notch1表达量明显升高,第2天Notch1表达量最高,第3天有所下降;2)用CD19cre-floxP体系诱导B细胞上特异性敲除Notch1基因,结果发现CD19creNotch1f/f基因型小鼠与 Notch1f/f CD19creNotch1f/+比,Notch1 的表达量明显下降;3)分选出Notch1f/f CD19creNotch1f/+、CD19creNotch1f/f基因型小鼠的脾脏B细胞,在体外用LPS刺激培养,结果发现Notch1f/f、CD19creNotch1f/+基因型小鼠抗体水平明显升高,而CD19creNotch1f/f抗体水平几乎没有变化,这表明B细胞特异性敲除Notch1后会使B细胞经LPS诱导产生的抗体分泌减少;4)用LPS体外刺激培养Notch1f/f、CD19creNotch1f/+、CD19creNotch1f/f三种基因型小鼠的全脾脏细胞,用ELISA检测培养上清中的抗体浓度,结果发现三种基因型小鼠抗体分泌水平都明显上升,B细胞特异性敲除Notch1后不会影响全脾细胞经LPS诱导后抗体的产生;5)Notch1f/f、CD19creNotch1f/+和CD19creNotch1f/f三种基因型小鼠同时诱导EAE模型,ELISA检测血清中抗体浓度,结果发现B细胞特异性敲除Notch1后不会影响血清中的抗体水平;6)经检测,脾脏中除了B细胞,其它细胞上也表达Notch1,B细胞上除了表达Notch1,也表达Notch1的配体Dll1和Jag1,B细胞特异性敲除Notch1后,其它细胞上表达的Notch1会与B细胞上表达的Dll1或Jag1相结合,促进抗体的产生。结论Notch1及其配体在诱导B细胞产生抗体方面发挥重要作用。