单核增生性李斯特氏菌（Listeria Monocytogenes, LMO）是人和动物一种重要的食源性细菌,该菌属于革兰氏阳性小杆菌,在免疫缺陷的病人、新生儿、孕妇及动物可导致十分严重的病,称之为李氏杆菌病。该病以脑脊髓炎、脑膜炎、败血病、流产为主要特征。LMO对环境抵抗里很强,可以在酸性、高盐及低温环境下生存,在生的或加工过的食品中也可以发现LMO。LMO还可以在厌氧的环境中生长,在真空包装的食品中仍然可以发现LMO。当食用了LMO污染的食物后,LMO很快穿透肠道屏障到达肝脏和脾脏,之后散布到脑和胎盘。LMO可以寄生在吞噬细胞中,并可以在吞噬泡膜上打孔而进入宿主胞浆中复制。近几年LMO在各地引起的食物中毒,引起了科学家和政府官员的注意。本文在概述中介绍了LMO的背景、生物学特性、LMO的毒力因子、感染的分子生物学进展,并且比较分析了近几年LMO的检测技术研究进展。 李氏溶血素（Listeriolysin O, LLO）是LMO逃离宿主吞噬泡的主要毒力因子。LLO可以从单核增生性李斯特杆菌的培养基中获得,但这种方法需要大量的培养基。直到现在,依靠LMO分泌的天然LLO不能满足研究LMO分子生物学机制和对LMO的检测及对李氏杆菌病诊断的需要。本文利用含阳性质粒pGEX-6P-hly的重组大肠杆菌BL-21,利用IPTG作为诱导剂,探索了重组LLO的优化表达条件,包括IPTG的诱导浓度、诱导时间、诱导温度、诱导时机及培养基的选择等。得出在摇床培养的条件下,IPTG浓度为0.6mmol/L、诱导温度为37℃、诱导时间为150min、诱导时机为当细菌OD₆₀₀等于0.25时开始诱导,此时重组LLO的表达量最大。 本实验表达的蛋白是以包涵体的形式存在于大肠杆菌的胞浆中,所以,要想纯化蛋白,首先要纯化包涵体。本文对提包涵体的方法进行优化,获得了相对纯度比较高的包涵体。利用亲和层析纯化蛋白,获得了纯化的重组李氏溶血素蛋白。Western-blot分析证明,重组李氏溶血素融合蛋白具有免疫活性。融合蛋白可溶性分析证明,蛋白以几乎不溶于水的包涵体形式存在。 本研究利用纯化的重组李氏溶血素融合蛋白免疫家兔,获得诊断抗体。利用谷胱甘肽转移酶吸收处理诊断抗体,以消除诊断抗体中抗谷胱甘肽转移酶抗体的干扰。然后用此诊断抗体和BHI培养基培养的LMO上清发生反应,初步在实验室建立了阻断ELISA检测LMO的方法。实验优化了重组LLO的包被浓度,诊断抗体的最佳工作浓度,并进行了特异性分析和最低检测数分析,初步在实验室建立了利用重组LLO检测LMO的ELISA方法。