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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)是常规饲养猪群上呼吸道中寄生的一种常在菌,但在动物体应激、免疫力低下等情况下某些分离株可侵入机体并引发严重的全身性疾病,临床特征主要表现为纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等。近年来鉴于养殖场饲养模式的不断调整以及新型呼吸道疾病的层出不穷,副猪嗜血杆菌病日趋流行,对世界养猪业造成了巨大危害。近年来基因工程产业发展迅猛,使得疫苗的研发无论在方法上还是在观念上都发生了重大转变。当前应用基因重组技术构建沙门氏菌减毒菌株和利用减毒沙门氏菌作为活载体表达外源抗原研制多联疫苗等已成为研究热点之一。本课题是基于猪霍乱沙门氏菌C500菌株Aasd缺失株平衡致死载体系统进行副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程疫苗研发。基本思路是利用仔猪副伤寒商品疫苗菌株猪霍乱沙门氏菌C500作为宿主菌株,插入已经蛋白质组学方法筛选鉴定的副猪嗜血杆菌重要免疫原性基因hps06257、HbpB及PalA,从而获得副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程疫苗菌株C501(06257)、C501(HbpB)、 C501(PalA),并对这些重组菌株进行生物学特性鉴定、安全性评价以及免疫效应方面的研究,为临床副猪嗜血杆菌病的防制提供新对策。首先扩增目的基因并将其连接至原核载体质粒pYA3493中,获得中间质粒pYA-06257、pYA-HbpB、pYA-PalA。再将重组质粒电转至猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失菌株C501中,构建互补菌株C501(06257)、C501(HbpB)、C501(PalA)。PCR扩增鉴定和测序结果证实二联基因工程疫苗菌株构建成功。对上述重组菌株的生物学特性鉴定研究表明：1)重组菌株能够正确表达目的蛋白且保持其原有免疫特性；2)外源质粒可在宿主菌株中稳定遗传,保证了疫苗菌株的遗传稳定性；3)外源基因的插入对于载体菌株的生长没有特别影响；4)在碳代谢方面重组菌与亲本菌生化特征一致,外源质粒的克隆与表达不影响沙门氏菌自身的碳代谢。重组菌株对小鼠的半数致死量检测结果显示,C501(06257)、C501(HbpB)、 C501(PalA)与空质粒对照菌株C501(pYA3493)在小鼠体内LD50非常接近,证明外源基因片段的插入基本不影响载体菌的弱毒特性。在本体动物仔猪体内进行重组疫苗菌株的安全性评估,结果表明口服或肌肉注射10倍免疫剂量(300亿)的疫苗菌株后仔猪的采食、饮水及精神状态均比较正常,机体只在接种后第二天发生轻微发热之外并无其他明显的临床症状。副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程疫苗对小鼠的免疫效力评价试验结果表明：针对副猪嗜血杆菌强毒株致死剂量攻毒,口服组的攻毒保护率明显高于注射组,其中C501(HbpB)口服组、C501(PalA)口服组免疫小鼠分别具有83.3%、100%的保护率；针对猪霍乱沙门氏菌强毒株的致死攻毒结果表明,口服组的攻毒保护率略低于注射组,其中C501(HbpB)注射组、C501(Pa1A)注射组均能为机体提供87.5%的保护力。从整体来看不论是口服方式还是注射途径,重组疫苗组的免疫保护力均高于对照组,能够为机体抵抗沙门氏菌感染提供良好的保护力。