近20年来,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已被开发成为一种十分成功的外源蛋白表达系统。该表达系统具有成本低、表达量高、遗传稳定、分泌效率高等诸多优点并在世界各地实验室和工厂中得到广泛应用。巴斯德毕赤酵母表达系统获得高度成功的重要因素之一在于其具有一个高强度、易调控的AOX1启动子。但是AOXl启动子须用高毒且易燃易爆的甲醇来诱导表达。甲醇的运输、储存和使用过程无疑是工业生产中一个很大的安全隐患。近年来,巴斯德毕赤酵母甲醛脱氢酶(formaldehyde dehydrogenase, FLD1)的启动子日益受到科研人员的重视。FLD1启动子的启动强度、调控的严谨性均和AOX1启动子相仿。同时,FLD1启动子可用甲胺盐来诱导表达。和甲醇相比,甲胺盐毒性低、使用安全且不易挥发。因此无论在实验室还是在工厂中,使用甲胺盐更加方便、安全。为了提高MPH表达量为工业生产打下基础,在本研究中我们采用FLDl强启动子来带动MPH的分泌表达。首先我们通过重叠延伸PCR融合了FLDl启动子和α-mating factor信号肽序列,并构建了巴斯德毕赤酵母分泌表达型载体pEFαA。然后将我们实验室之前根据巴斯德毕赤酵母偏嗜性密码子重新合成的MPH编码基因smpd定向克隆到pEFαA表达载体中,构建了MPH表达载体pEFαA-smpd。通过电击转化,将pEFαA-smpd导入到巴斯德毕赤酵母X33菌株中获得了一批表达菌株。在FLD1启动子的驱动下,MPH蛋白在酵母菌株中得到了持续性分泌表达。培养72 h后培养基中积累的MPH酶活约为5.4 U/mL。在表达甲基对硫磷水解酶的研究中我们发现分泌到胞外的MPH蛋白有两个大小不同的条带。除了预期的MPH条带外,还有一条较小的蛋白条带。分析后发现巴斯德毕赤酵母自身的Kex2蛋白酶可以识别MPH序列中的KR (-Lys-Arg-)位点并从N端切割掉37个氨基酸残基形成截短MPH蛋白。分析MPH蛋白三维结构后,我们发现切掉的氨基酸残基中很可能存在参与构成MPH活性中心或者在甲基对硫磷水解中发挥重要作用的氨基酸残基。因此失去N端37个氨基酸残基的截短MPH的催化活性很可能会有较大下降。同时分泌表达到培养基中的截短MPH通常占到MPH总量的30%以上。这些截短MPH可能会严重影响培养基上清中MPH的总酶活。另一方面,MPH中KR位点会与信号肽中的KR序列竞争有限的Kex2蛋白酶而导致分泌效率下降。基于这两点原因,我们通过PCR方法定点突变了MPH中的KR位点。其中将MPH中KR位点突变为KK的MPH编码序列smpdK相对于突变前的smpd能够显著地提高上清液中的MPH酶活。酶活平均提高了59%,由原来的5.4 U/mL增加到8.6 U/mL。提高外源蛋白表达框的拷贝数往往可以显著地提高外源蛋白表达量。接下来的试验中,我们将FLD1启动子驱动的MPH表达框整合到可用于筛选高拷贝转化子的pPIC9K质粒上,并替换掉原来的AOXl启动子区来构建MPH表达质粒p9KFLD-smpdK。我们首先采用电穿孔转化法获得了大量转化子并用高浓度的G418抗生素平板来筛选多拷贝转化子。然后依据酵母细胞传代培养中会自发形成更高拷贝表达菌株的原理,我们通过逐步提高G418浓度来筛选含有更高拷贝表达框的酵母重组子。其中可以抗8000 mg/L和12000 mg/L G418的重组菌株的MPH表达量可达45 U/mL,即提高外源基因拷贝数又使MPH总酶活提高了5倍左右。我们另一方面的研究集中于巴斯德毕赤酵母遗传操作体系的建立上。我们优化并完善了一种巴斯德毕赤酵母无标记基因删除方法。我们先后改进了转化方案,使得每次操作均可获得100个以上阳性转化子；分析了敲除盒的染色体整合效率、敲除盒的自我剪切效率和最终完全正确转化子得率,充分证明了该方案的有效性；并验证了该方法在同一遗传背景下进行重复使用的可行性。我们可以使用该方法来删除巴斯德毕赤酵母基因而不会引入任何选择标记基因。该方法联合了融合PCR、Cre/lox系统和AOX1启动子的多方优点,整个基因删除过程可在5天内完成,比起目前可用的其它巴斯德毕赤酵母无标记基因删除方法来更加准确快捷。目前巴斯德毕赤酵母的表达质粒基本上都是没有真核复制起点的整合型质粒。这些表达质粒可通过同源重组整合到酵母染色体上,并随染色体复制而复制。在转化前,科研人员往往先用限制性内切酶将表达质粒在同源重组区线性化,然后电击转化巴斯德毕赤酵母感受态细胞筛选阳性克隆子。在研究中我们发现用环状表达质粒电击转化酵母感受态细胞,亦可稳定的获得足够数量的转化子。这样就解决了线性化质粒中可能遇到的以下两个问题：(1)外源蛋白编码基因和同源重组区含有相同的限制性内切酶切割位点而导致没有合适的质粒线性化位点；(2)当一个质粒上含有多个表达框时,切割作为重组位点的启动子区会将表达质粒切成多个片段,因此转化后不能将质粒的全部表达框整合到酵母染色体上。研究中我们发现以巴斯德毕赤酵母常用的AOX1、FLD1、GAP启动子区为同源重组区的环状质粒均可以一定效率整合到巴斯德毕赤酵母染色体上,从而科研人员可以更方便灵活地使用该系统表达外源蛋白。