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小麦叶锈病是由隐匿柄锈菌(Puccinia triticina)侵染的一种气传性真菌病害，在全世界范围均有发生，对小麦造成严重的产量损失。我国小麦叶锈病发生面积大，危害严重，成为影响小麦生产的关键因素。但由于小麦叶锈菌致病性多样化及毒性的频繁发生变异，导致小麦抗叶锈性不断丧失，所以病害的防治一直处于被动状态。因此，研究小麦叶锈菌致病的分子机制对控制小麦叶锈病尤为重要。
本论文通过构建三个小麦叶锈菌单胞菌系08-5-9-2(KHTT)、13-5-28-1(JHKT)和13-5-72-1(THSN)在休眠孢子、萌发夏孢子和侵染6d时期的小麦叶锈菌转录组文库，系统筛选候选效应蛋白(effector candidates)，分析候选效应蛋白的表达模式，鉴定效应蛋白毒性功能结构域，分析效应蛋白的作用位点，解析效应蛋白的毒性和无毒性功能。
主要研究结果如下:
1.成功构建三个小麦叶锈菌生理小种单胞菌系的转录组文库。本研究在获得高质量RNA的基础上，使用Illumina Hiseq平台进行测序，总计产出2144.04Mb的Raw Reads，1584.76Mb的Clean Reads，对clean reads进行组装，组装的转录本进行聚类并去冗余后得到189，266个Unigene，其中123，590条(65.3％)Unigene长度大于500bp，说明测序和组装的效果很好。将189，266条Unigene与七大功能数据库(NR、NT、GO、KOG、KEGG、Swissprot和Interpro)进行Blastx比对发现，共有146，991条获得了基因注释，其中有28.7％和10.27％的序列分别与小麦秆锈菌及小麦条锈菌的序列同源。73，726条Unigene被注释到25个KOG类别中;GO注释分为生物学过程(Biological process)，细胞组分(Cellular component)和分子功能(Molecular Function)三大类共55小类;KEGG涉及21个代谢通路。三个锈菌菌株在三个阶段均分别存在差异表达基因，侵染阶段与其它两阶段相比的差异表达基因最多，因此三个文库的构建为小麦叶锈菌效应蛋白的筛选奠定了基础。
2.利用生物信息学技术进行候选效应蛋白的筛选。通过生物信息学筛选得到427个小麦叶锈菌候选效应蛋白和36个与Lr20候选无毒基因具有同源性的基因;对它们进行聚类分析，发现近2/3的候选效应蛋白在侵染6d时表达量显著上调;选择45个候选效应基因进行克隆，成功克隆到38个候选效应蛋白基因;qRT-PCR分析了38个候选效应蛋白的表达模式，发现候选效应蛋白在叶锈菌不同发育阶段表达模式多样化。
3.利用异源表达对效应蛋白进行毒性分析。通过将38个候选效应蛋白与BAX共同注射烟草，获得33个小麦叶锈菌的效应蛋白，其中在烟草上表现能够有效抑制BAX诱导的PCD的效应蛋白32个，在烟草上能够诱导坏死反应的1个，为Pt18523;选择能抑制BAX诱导的PCD的效应蛋白Pt20454和Pt31812进行缺失突变体分析，发现其功能域分别位于N-末端50-79和22-88位氨基酸。
4.效应蛋白的结构分析及亚细胞定位。通过数据库对候选效应蛋白结构特征的分析发现，33个效应蛋白中只有Pt12680有功能注释，为铜锌超氧化物歧化酶，其余均为假定蛋白。利用Pfam软件对33个效应蛋白进行分析，只有Pt3081中存在一个E1_DerP2_DerF2结构域，其他基因都不存在任何已知的Pfam motif。分泌蛋白一级结构分析发现，33个效应蛋白除Pt3372外，其余均含半胱氨酸，Pt34354中半胱氨酸含量高达14个。对Pt18523、Pt20454和Pt31812共3个效应蛋白（携带信号肽）进行亚细胞定位，发现3个融合表达蛋白均定位于烟草细胞内，表明效应蛋白在寄主细胞内发挥作用;对3个效应蛋白进行种内多态性分析，发现除Pt18523在138位氨基酸有一个突变外，其余序列均比较保守。
5.效应蛋白的功能分析。利用寄主诱导的基因沉默技术(HIGS)在近等基因系TcLr1和TcLr2a及TcLr18中沉默7个效应蛋白基因，结果Pt20454在小麦叶锈菌JHKT侵染TcLr1过程中起毒性作用，而Pt3372则在JHKT侵染TcLr2a和TcLr18中起毒性作用。沉默Pt20454基因的两个片段Pt20454-1as和Pt20454-2as，发现其对小麦叶锈菌JHKT侵染TcLr1时的致病表型影响不显著，然而组织学观察发现沉默Pt20454-2as时，在叶锈菌侵染的24h和48h只形成了气孔下囊，而Pt20454-1as沉默植株虽然在48h形成了吸器母细胞，但是个数也极少，推测其与病原菌的早期发育有关，特别是与侵染钉和吸器的形成有一定关系。沉默Pt3372基因后，TcLr2a和TcLr18的反应型由“4”分别变为“;1”和“;”，组织学观察发现120h时，沉默Pt3372的TcLr2a中也只出现了少量的次生菌丝和吸器，而TcLr18中仍是只有吸器母细胞，两者都伴随着大量的坏死，推测Pt3372在小麦叶锈菌侵染TcLr2a和TcLr18时发挥了毒性作用。在41个含有不同抗叶锈病基因的近等基因系（单基因系）中瞬时表达7个效应蛋白基因，发现Pt31812在近等基因系TcLr25中和单基因系Lr42中过表达引起细胞坏死，Pt3372在近等基因系TcLr28中过表达引起细胞坏死。利用HIGS技术对Pt31812在小麦叶锈菌THSN侵染单基因系Lr42时进行了沉默，分析发现沉默Pt31812基因后，单基因系Lr42的反应型由“0”变为“3”，组织学观察发现120h时，沉默Pt31812的单基因系Lr42中出现了菌丝团，说明Pt31812在小麦叶锈菌侵染单基因系Lr42过程中发挥无毒性功能。
本研究证实了小麦叶锈菌含有丰富的效应蛋白，效应蛋白在小麦叶锈菌侵染过程中大量产生，效应蛋白缺乏保守结构域，效应蛋在植物细胞内抑制或诱导植物的防卫反应从而表现其毒性功能或无毒性功能。初步鉴定了Pt3372和Pt31812分别是在小麦叶锈菌侵染TcLr28和TcLr25及单基因系Lr42过程中发挥无毒性作用的效应蛋白，初步发现Pt3372和Pt20454为近等基因系TcLr2a及TcLr18和TcLr1的候选毒性基因。
本论文通过构建三个小麦叶锈菌单胞菌系08-5-9-2(KHTT)、13-5-28-1(JHKT)和13-5-72-1(THSN)在休眠孢子、萌发夏孢子和侵染6d时期的小麦叶锈菌转录组文库，系统筛选候选效应蛋白(effector candidates)，分析候选效应蛋白的表达模式，鉴定效应蛋白毒性功能结构域，分析效应蛋白的作用位点，解析效应蛋白的毒性和无毒性功能。
主要研究结果如下:
1.成功构建三个小麦叶锈菌生理小种单胞菌系的转录组文库。本研究在获得高质量RNA的基础上，使用Illumina Hiseq平台进行测序，总计产出2144.04Mb的Raw Reads，1584.76Mb的Clean Reads，对clean reads进行组装，组装的转录本进行聚类并去冗余后得到189，266个Unigene，其中123，590条(65.3％)Unigene长度大于500bp，说明测序和组装的效果很好。将189，266条Unigene与七大功能数据库(NR、NT、GO、KOG、KEGG、Swissprot和Interpro)进行Blastx比对发现，共有146，991条获得了基因注释，其中有28.7％和10.27％的序列分别与小麦秆锈菌及小麦条锈菌的序列同源。73，726条Unigene被注释到25个KOG类别中;GO注释分为生物学过程(Biological process)，细胞组分(Cellular component)和分子功能(Molecular Function)三大类共55小类;KEGG涉及21个代谢通路。三个锈菌菌株在三个阶段均分别存在差异表达基因，侵染阶段与其它两阶段相比的差异表达基因最多，因此三个文库的构建为小麦叶锈菌效应蛋白的筛选奠定了基础。
2.利用生物信息学技术进行候选效应蛋白的筛选。通过生物信息学筛选得到427个小麦叶锈菌候选效应蛋白和36个与Lr20候选无毒基因具有同源性的基因;对它们进行聚类分析，发现近2/3的候选效应蛋白在侵染6d时表达量显著上调;选择45个候选效应基因进行克隆，成功克隆到38个候选效应蛋白基因;qRT-PCR分析了38个候选效应蛋白的表达模式，发现候选效应蛋白在叶锈菌不同发育阶段表达模式多样化。
3.利用异源表达对效应蛋白进行毒性分析。通过将38个候选效应蛋白与BAX共同注射烟草，获得33个小麦叶锈菌的效应蛋白，其中在烟草上表现能够有效抑制BAX诱导的PCD的效应蛋白32个，在烟草上能够诱导坏死反应的1个，为Pt18523;选择能抑制BAX诱导的PCD的效应蛋白Pt20454和Pt31812进行缺失突变体分析，发现其功能域分别位于N-末端50-79和22-88位氨基酸。
4.效应蛋白的结构分析及亚细胞定位。通过数据库对候选效应蛋白结构特征的分析发现，33个效应蛋白中只有Pt12680有功能注释，为铜锌超氧化物歧化酶，其余均为假定蛋白。利用Pfam软件对33个效应蛋白进行分析，只有Pt3081中存在一个E1_DerP2_DerF2结构域，其他基因都不存在任何已知的Pfam motif。分泌蛋白一级结构分析发现，33个效应蛋白除Pt3372外，其余均含半胱氨酸，Pt34354中半胱氨酸含量高达14个。对Pt18523、Pt20454和Pt31812共3个效应蛋白（携带信号肽）进行亚细胞定位，发现3个融合表达蛋白均定位于烟草细胞内，表明效应蛋白在寄主细胞内发挥作用;对3个效应蛋白进行种内多态性分析，发现除Pt18523在138位氨基酸有一个突变外，其余序列均比较保守。
5.效应蛋白的功能分析。利用寄主诱导的基因沉默技术(HIGS)在近等基因系TcLr1和TcLr2a及TcLr18中沉默7个效应蛋白基因，结果Pt20454在小麦叶锈菌JHKT侵染TcLr1过程中起毒性作用，而Pt3372则在JHKT侵染TcLr2a和TcLr18中起毒性作用。沉默Pt20454基因的两个片段Pt20454-1as和Pt20454-2as，发现其对小麦叶锈菌JHKT侵染TcLr1时的致病表型影响不显著，然而组织学观察发现沉默Pt20454-2as时，在叶锈菌侵染的24h和48h只形成了气孔下囊，而Pt20454-1as沉默植株虽然在48h形成了吸器母细胞，但是个数也极少，推测其与病原菌的早期发育有关，特别是与侵染钉和吸器的形成有一定关系。沉默Pt3372基因后，TcLr2a和TcLr18的反应型由“4”分别变为“;1”和“;”，组织学观察发现120h时，沉默Pt3372的TcLr2a中也只出现了少量的次生菌丝和吸器，而TcLr18中仍是只有吸器母细胞，两者都伴随着大量的坏死，推测Pt3372在小麦叶锈菌侵染TcLr2a和TcLr18时发挥了毒性作用。在41个含有不同抗叶锈病基因的近等基因系（单基因系）中瞬时表达7个效应蛋白基因，发现Pt31812在近等基因系TcLr25中和单基因系Lr42中过表达引起细胞坏死，Pt3372在近等基因系TcLr28中过表达引起细胞坏死。利用HIGS技术对Pt31812在小麦叶锈菌THSN侵染单基因系Lr42时进行了沉默，分析发现沉默Pt31812基因后，单基因系Lr42的反应型由“0”变为“3”，组织学观察发现120h时，沉默Pt31812的单基因系Lr42中出现了菌丝团，说明Pt31812在小麦叶锈菌侵染单基因系Lr42过程中发挥无毒性功能。
本研究证实了小麦叶锈菌含有丰富的效应蛋白，效应蛋白在小麦叶锈菌侵染过程中大量产生，效应蛋白缺乏保守结构域，效应蛋在植物细胞内抑制或诱导植物的防卫反应从而表现其毒性功能或无毒性功能。初步鉴定了Pt3372和Pt31812分别是在小麦叶锈菌侵染TcLr28和TcLr25及单基因系Lr42过程中发挥无毒性作用的效应蛋白，初步发现Pt3372和Pt20454为近等基因系TcLr2a及TcLr18和TcLr1的候选毒性基因。