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背景和目的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）T细胞疗法是目前肿瘤治疗领域最有前景的治疗方法之一,并且在血液瘤的治疗中取得了令人振奋的效果,多种自体CAR-T细胞治疗产品也已获批上市。然而,这种高效的肿瘤治疗方法在临床治疗中也有一定的局限性,尤其是细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome,CRS）,部分患者会因其危及生命。目前临床上控制CRS的主要手段包括使用IL-6受体阻断剂托珠单抗注射液或者糖皮质激素,但是这些治疗手段具有一定的局限性,患者发生活动性感染时应用托珠单抗注射液会加重感染,而糖皮质激素的应用会影响CAR-T细胞的功能,因此寻找一种新的治疗方法是非常有必要的。间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）是一种具有免疫调节作用的细胞。研究表明MSCs可以用于治疗COVID-19引起的CRS,而CAR-T细胞治疗相关的CRS与COVID-19引起的CRS的病理过程是有一定相似性的。因此我们考虑应用MSCs作为控制CAR-T细胞治疗相关CRS的手段之一。外泌体是由脂质双层膜组成的球形囊泡,内含蛋白质、核酸等复杂而丰富的活性物质。间充质干细胞外泌体（mesenchymal stem cell-derived exosomes,MSC-Exos）是由MSCs分泌的球形囊泡,含有许多抗炎化合物,并通过与免疫效应细胞相互作用调节免疫反应。在自身免疫性疾病的治疗中,MSC-Exos作为无细胞治疗的载体受到了广泛的关注,因为它们不仅承载了 MSCs本身的大部分治疗效果,并且还减少了注射活细胞安全性的担忧。MSC-Exos在临床治疗中具有明显优势,未来可能完全替代MSCs治疗。因此,本研究认为MSC-Exos能够减轻CAR-T细胞治疗引起的CRS。已有文献报道,CAR-T细胞治疗过程中诱发的CRS与巨噬细胞有密切的关系。在CRS的发生过程中起到重要作用的细胞因子就是IL-1β和IL-6,而IL-1β是整个炎症反应过程的“开关”,是处于整个炎症反应过程的上游位置的。研究表明IL-1β的产生主要与巨噬细胞NLRP3和AIM2炎性小体有关。因此本课题旨在阐明CAR-T细胞杀伤引起的CRS主要与哪个炎性小体激活有关,并且对MSC-Exos进行改造,使其具有更强的抑制CRS的能力。方法1.从郑州大学第一附属医院产科收集健康产妇脐带组织,使用组织块法分离培养MSCs,并使用油红O和茜素红S染色鉴定其定向分化能力,用流式细胞术鉴定其特定表面标志的表达。2.用超速离心法提取MSC-Exos,并用免疫印迹法（Western Blot,WB）、电镜和NTA粒径对外泌体进行鉴定。3.在体外将外泌体与CAR-T细胞共孵育,用流式细胞术检测外泌体对CAR-T细胞杀伤功能和增殖功能的影响,将MSC-Exos与肿瘤细胞,巨噬细胞以及CAR-T细胞共孵育,用多因子（Cytometric Bead Array,CBA）检测对细胞因子产生的影响。4.用WB检测肿瘤细胞,巨噬细胞和CAR-T细胞共孵育后巨噬细胞炎性小体激活情况。5.用慢病毒感染THP-1细胞以敲低THP-1细胞中的NLRP3和AIM2基因,用WB筛选出敲低效率最好的细胞株进行共孵育实验,用CBA验证在CAR-T细胞杀伤引起的CRS中起到重要作用的炎性小体。6.在共孵育体系中加入炎性小体相关抑制剂,用CBA检测细胞因子的产生情况。7.用数据库筛选与炎性小体表达相关的miRNA,并合成其模拟物,然后用qRT-PCR验证转染效率以及外泌体中该miRNA的表达情况,将外泌体与MDM共孵育,用qRT-PCR检测外泌体能否作用于巨噬细胞。8.提取转染过miRNA模拟物的MSC-Exos,加入到肿瘤细胞,巨噬细胞和CAR-T细胞共孵育体系中,用CBA检测细胞因子的产生情况。结果1.体外成功分离培养了 hUC-MSCs并通过鉴定证明其符合MSCs的定义。2.体外提取了 MSC-Exos并通过鉴定证明其符合外泌体的特征。3.MSC-Exos不影响CAR-T细胞的杀伤功能和增殖能力。对CAR-T细胞杀伤引起的CRS有一定的抑制作用。4.WB和多因子检测结果显示,CAR-T细胞杀伤引起了 CRS,其主要原因是巨噬细胞NLRP3炎性小体的激活。5.基因敲低结果显示与AIM2炎性小体相比NLRP3炎性小体在CAR-T细胞杀伤引起的CRS中起到了更重要的作用。6.NLRP3炎性小体相关抑制剂的加入可以抑制CAR-T细胞杀伤引起的CRS。7.数据库筛选出与NLRP3和CASP1相关的miRNA即miR-3194-3p,并对MSCs进行转染,结果显示转染miR-3194-3p模拟物的MSCs外泌体中能够检测到miR-3194-3p,并且外泌体能被巨噬细胞吞噬。8.含有miR-3194-3p的MSC-Exos能够抑制CAR-T细胞杀伤引起的CRS。结论巨噬细胞NLRP3炎性小体激活促进了 CAR-T细胞杀伤引起的CRS;含miR-3194-3p的MSC-Exos抑制了 CAR-T细胞杀伤引起的CRS。