【摘 要】
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扩展青霉（Penicillium expansum）是引起果蔬采后青霉病发生的重要病原菌,不仅导致果蔬腐烂变质,同时产生展青霉素而危及人类健康。因此,有效控制扩展青霉的生长对减少果蔬采后损失具有重要意义。新型杀菌剂的开发耗时长,成本高,“老药新用”的快速发展为解决这一难题提供了契机。本研究以扩展青霉为靶标菌株,研究了32种具有抗菌活性的临床药物对扩展青霉的抑制作用,并筛选出价格低廉、对扩展青霉具有
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扩展青霉（Penicillium expansum）是引起果蔬采后青霉病发生的重要病原菌,不仅导致果蔬腐烂变质,同时产生展青霉素而危及人类健康。因此,有效控制扩展青霉的生长对减少果蔬采后损失具有重要意义。新型杀菌剂的开发耗时长,成本高,“老药新用”的快速发展为解决这一难题提供了契机。本研究以扩展青霉为靶标菌株,研究了32种具有抗菌活性的临床药物对扩展青霉的抑制作用,并筛选出价格低廉、对扩展青霉具有杀菌效果显著的药物联苯苄唑。在此基础上,进一步研究了联苯苄唑的抑菌特性及其作用机制。主要研究结果如下:（1）从临床药物中筛选抗扩展青霉的活性物质本文采用孢子萌发法,研究了32种临床药物对扩展青霉的抑制效果及其作用规律。结果表明:硝酸咪康唑、克霉唑、联苯苄唑、酮康唑、5-氟胞嘧啶、纳他霉素、依布硒等对扩展青霉具有显著的抑制效果,EC50值均低于2μg/m L。其中,联苯苄唑的EC50值为0.04μg/m L。在不同种类的药物中,咪唑类药物对扩展青霉的抑菌活性最强,其次为吩噻嗪和酚类药物,而内酯类药物的抑菌活性最差。（2）联苯苄唑抑制扩展青霉的特性研究联苯苄唑对扩展青霉的孢子萌发、菌丝生长均表现出显著的抑制作用,并呈现显著的浓度效应。p H、温度和金属离子等环境条件的变化对联苯苄唑的抑菌活性没有显著影响。紫外照射处理会降低联苯苄唑对扩展青霉的抑制效果。进一步的体外接种扩展青霉的试验表明,联苯苄唑处理显著降低了皇冠梨果实的病斑直径,对‘皇冠梨’果实青霉病表现出显著的抑制作用。（3）联苯苄唑对扩展青霉细胞结构和功能的影响分别采用光学显微镜、扫描电镜和透射电镜观察的方法研究了联苯苄唑处理对扩展青霉菌丝体细胞超微结构的影响,发现联苯苄唑处理严重破坏了扩展青霉菌丝的形态和结构;经联苯苄唑处理的扩展青霉菌丝体出现断裂、分支、细胞扭曲和顶端膨大变形等现象。细胞内部结构出现质壁分离、空泡化、细胞质分布不均匀;大量细胞的细胞膜出现由外至内逐渐消失的现象;通过荧光增白剂染色和几丁质含量测定发现联苯苄唑处理并未对菌体细胞的细胞壁产生显著影响;采用碘化丙啶和伊文思兰染色发现,联苯苄唑处理严重破坏了真菌菌丝体细胞的细胞膜完整性;进一步研究发现,经联苯苄唑处理的真菌菌丝体细胞的细胞膜透性显著增加,致使核酸、蛋白质、离子等内容物的大量渗出。（4）联苯苄唑处理对扩展青霉菌丝体细胞膜组分、功能以及细胞死亡关键因子的影响采用气质联用技术研究联苯苄唑处理对细胞膜组分的影响,发现联苯苄唑处理后的菌丝体细胞不饱和脂肪酸含量显著增加,细胞膜组分麦角甾醇的含量显著降低。此外,采用DPH荧光探针染色的方法发现联苯苄唑处理增大了菌丝体细胞膜的流动性;进一步研究发现联苯苄唑显著提高了细胞膜上的三种主要的离子泵Ca2+/Mg2+-ATPase,Na+/K+-ATPase和H+/K+-ATPase的活性。经联苯苄唑处理后细胞内游离Ca2+、H+和活性氧（ROS）含量显著增加;细胞抗氧化酶CAT、POD活性显著增加;膜脂过氧化产物丙二醛显著积累。同时,联苯苄唑处理在一定程度上影响了线粒体功能,线粒体的膜电位出现紊乱,呼吸作用受到一定程度的抑制。经过联苯苄唑处理的真菌菌丝体细胞的能量代谢受到显著抑制,ATP、ADP和AMP的含量显著低于对照水平。（5）联苯苄唑处理导致扩展青霉菌体细胞死亡的作用途径分析细胞内Ca2+、ROS的大量积累和能量的亏损会进一步导致细胞死亡。采用Hoechst 33258染色分析发现,联苯苄唑处理后扩展青霉菌丝中染色质聚缩,造成了扩展青霉菌丝细胞凋亡。进一步采用细胞凋亡抑制剂Necrostatin-1和坏死专一性抑制剂Z-VAD-FMK对联苯苄唑导致的菌体细胞死亡途径进行初步判断,发现两种抑制剂均能在一定程度上缓解联苯苄唑导致的菌体细胞死亡。因此,联苯苄唑处理可能通过细胞凋亡和细胞坏死作用途径导致了扩展青霉菌体的死亡。
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