卵巢癌在全球女性妇科疾病中病死率居首位,也是第五大癌症相关死亡原因。据估计,全球每年有近30万卵巢癌新增病例,死亡病例高达18万左右,严重威胁女性健康。卵巢癌有多种病理亚型,其中上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）最常见,约占据全部卵巢癌的70%。由于缺乏早期临床表现及早期的筛查手段,导致大部分EOC患者就诊时已属晚期。目前,上皮性卵巢癌一线治疗方案仍然是满意的肿瘤细胞减灭术联合以铂类为主的化疗。尽管近30年以来,外科手术操作日益精湛,化疗药物研发也日新月异,但是晚期EOC患者的5年生存率并没有显著的提高。因此为上皮性卵巢癌提供新的治疗方案或治疗靶点一直都是该领域的研究热点及难点。卵巢不仅是性激素的分泌器官,也是性激素的靶器官,卵巢的生理、病理和性激素密切相关。流行病学研究发现EOC的发病年龄多集中在围绝经及绝经后妇女。围绝经期及绝经后期女性体内性激素特点发生了巨大变化,主要表现为雌激素、孕激素水平快速而又剧烈降低,而雄激素水平随着年龄的增长降低较平缓,并维持多年;另一方面由于雌激素的显著下降,使得血清中雄激素与雌激素的比例上升显著,性激素结合球蛋白降低,使得游离雄激素增高。因此,围绝经期及绝经后妇女的雄激素水平处于相对或绝对过剩状态。这一特点是否与EOC发病风险增加相关?研究结果尚不统一,早年的研究多认为二者无相关性,但是最近美国的一项病例对照研究对1331例EOC病例和3017例对照组确诊前循环雄激素水平进行测定,结果认为睾酮水平与EOC风险呈正相关。多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）患者、肥胖患者循环中游离睾酮较正常人升高,与EOC的发病风险呈现正相关,而口服避孕药可以降低循环雄激素,因此可以降低EOC发病风险。有服用雄激素病史的女性EOC发病风险显著增加。综上,诸多证据表明雄激素在EOC的发生发展中发挥着重要的作用。但是无论是氟他胺、还是比卡鲁胺抗雄激素治疗EOC的Ⅱ期临床研究中均未取得显著的抗肿瘤作用,这一结论与流行性学、体内外的实验研究相矛盾,引发广大学者的思考。本研究拟利用河北医科大学第二医院确诊的卵巢癌患者组织标本并结合卵巢癌细胞系,探讨雄激素、雄激素受体在上皮性卵巢癌中的影响作用,并初步探索其相关作用机制。第一部分雄激素受体在上皮性卵巢癌组织及癌旁组织中的表达及其临床意义目的:本研究拟利用河北医科大学第二医院确诊的上皮性卵巢癌患者癌组织标本及其癌旁正常卵巢组织标本进行研究,探索雄激素受体在上皮性卵巢癌组织中的表达及其临床意义。方法:收集2010年10月-2013年1月在河北医科大学第二医院妇科就诊并手术病理确诊的上皮性卵巢癌患者组织标本共116例,取材后及时石蜡包埋组织,所有患者术前均未进行任何内分泌治疗,且不合并其他系统的原发性恶性肿瘤、严重全身感染以及其他甲状腺功能亢进、甲状腺功能减低等内分泌疾病。术后严密随访患者五年。临床资料及随访资料完整者标本,委托上海芯超生物有限公司制备组织芯片,再次经病理医师确诊、定位取材,排除因肿瘤坏死严重、标本取材不准确等原因导致的不合格标本,组织芯片最终共包含87点,其中上皮性卵巢癌组织共70点,癌旁组织17点,每点直径1.5 mm。标本收集及病史采集均征得相关人员知情同意,并得到河北医科大学第二医院伦理委员会批准。用免疫组化SP法对组织芯片进行雄激素受体检测,以PBS代替一抗作为阴性对照。共取组织芯片5张,厚度5μm,其中一张用于组织HE染色,一张用于阴性对照,另外三张用于雄激素受体检测。结果判读由TG公司的全景组织细胞定量分析系统（Strata FAXS-样本分析系统）分析。同时用传统的十三点评分法核对自动分析结果。结果:1.上皮性卵巢癌组织及癌旁组织中AR的表达情况组织芯片的免疫组织化学染色结果显示AR在细胞核表达,DAB染色呈棕色及棕褐色颗粒。在上皮性卵巢癌组中,AR阳性率（67.1%）明显高于癌旁组织中（41.2%）,差异有统计学意义（P=0.048）;全景组织细胞定量系统分析结果显示在卵巢癌组织中的AR表达水平为1.51（8.64）,明显高于卵巢癌旁组织0.94（1.98）,差异有统计学意义（P=0.017）。因资料呈非正态分布,使用中位数（四分位间距）进行描述,非参数秩和检验进行比较。2.AR在上皮性卵巢癌患者中表达的临床意义上皮性卵巢癌患者中,以AR是否表达分为AR阳性组和AR阴性组。AR阳性组的年龄54（24）、孕次3（2）、产次2（2）与AR阴性组的年龄54（13）、孕次3（3）、产次2（1）相比,差异无统计学意义（P>0.05）。因年龄、孕产次资料不符合正态分布,因此结果用中位数（四分位间距）描述,非参数秩和检验进行统计分析。按FIGO分期分组,I-ⅡA期的AR阳性率68.2%,ⅡB-IV的AR阳性率66.7%,两组之间无统计学差异（P=0.900）;按病理分型分组,AR阳性率在卵巢浆液性癌组为72.9%,非浆液性癌组为54.5%,两组之间比较无统计学差异（P=0.129）;按肿瘤临床分级分组,在低级别的EOC中AR阳性率（76%）明显高于高级别的EOC（50%）,差异有统计学意义（P=0.041）。3.AR与卵巢癌预后的关系利用AR表达情况将上皮性卵巢癌组分为AR阳性组和AR阴性组利用Kaplan-Meier法分析两组EOC患者的生存情况,结果显示AR阳组患者预后较差（P=0.009）。小结:1.AR在上皮性卵巢癌组织中表达水平明显高于癌旁组织。2.AR的表达与患者年龄、孕产次、血浆CA125、肿瘤FIGO分期、肿瘤病理亚型无关;然而,AR在低级别的上皮性卵巢癌中的表达水平明显高于高级别上皮性卵巢癌。3.AR阳性为卵巢上皮性癌患者的一个不良预后因素。第二部分雄激素/雄激素受体对上皮性卵巢癌细胞增殖的影响目的:拟利用两种上皮性卵巢癌细胞系SKOV3、A2780为研究对象，探索雄激素（睾酮）对卵巢癌细胞增殖的影响,并进一步揭示经典的AR在其中所发挥的作用。方法:1.免疫荧光及Western blot方法检测SKOV3、A2780细胞系中AR表达情况。2.MTS方法检测不同浓度睾酮对SKOV3、A2780细胞的增殖的影响,并确定最适浓度及最适时间,作为后续研究的实验条件。每种细胞依据睾酮浓度及作用时间分为八组,分别为对照组（DMSO组）,1 n M处理组（T=1n M）,10 n M处理组（T=10 n M）,100 n M处理组（T=100 n M）,每组设两个时间,分别为24 h,48 h。3.氟他胺预处理SKOV3细胞1 h后,MTS检测睾酮促进SKOV3细胞增殖的影响。实验分组为对照组（DMSO组）,睾酮组（T）,氟他胺组（F）,氟他胺联合睾酮组（T+F）。4.利用质粒（sh310-AR）转染技术敲低SKOV3细胞的AR,利用RT-PCR检测质粒转染后AR核酸水平,同时利用WB检测转染后AR蛋白水平以确定sh310-AR对AR的敲低效力,MTS方法检测睾酮对于敲低AR的SKOV3细胞的促增殖作用。5.利用质粒（AB6398-AR）转染技术过表达SKOV3细胞的AR,利用RT-PCR、WB分别从RNA、蛋白水平促检测转染效率,MTS方法检测睾酮对于过表达AR的SKOV3细胞的增殖作用。6.利用质粒（AB6398-AR）转染技术将AR基因转入A2780细胞,利用RT-PCR、WB分别从RNA、蛋白水平检测转染效率,MTS方法检测睾酮对于转入AR基因的A2780细胞的促增殖作用。结果:1.免疫荧光检测结果显示SKOV3细胞AR高表达（37.88±8.64）,A2780细胞无明显AR表达;WB结果与免疫荧光结果相同,SKOV3细胞（0.40±0.13）,A2780细胞（0.01±0.00）,差异有显著性（P=0.008）。2.不同浓度的睾酮作用于SKOV3细胞24 h后,结果表明睾酮可以明显促进SKOV3细胞增殖,各组OD值:DMSO（2.01±0.01）、T=1 n M（2.22±0.08）、T=10 n M（2.35±0.10）、T=100 n M（2.44±0.06）,促增殖率分别为:10.45%（T=1 n M）、16.92%（T=10 n M）和21.39%（T=100 n M）,差异有显著性（P<0.05）;组间比较睾酮组与DMSO对照组均有显著差异（P<0.05）,T=1n M与其他各组之间差异有显著性（P<0.05）,然而T=10n M组与T=100 n M组之间无差异。当睾酮作用时间延长至48 h,各组OD值DMSO（2.00±0.69）、T=1 n M（2.24±0.07）、T=10 n M（2.25±0.12）、T=100 n M（2.13±0.10）;促细胞增殖率分别为12.15%（T=1 n M）、12.45%（T=10 n M）、6.35%（T=100 n M）,差异有显著性。三个浓度组组间比较:与DMSO组相比,T=1 n M、T=10n M组细胞增殖活力明显增强,差异有统计学意义;T=1 n M组与T=10 n M组比较差异无显著性,T=100 n M组较T=1 n M、T=10 n M促增殖率明显降低,但无统计学差异。相同浓度的睾酮、不同的时间组进行比较:T=1 n M时,24 h组与48h组比较差异无统计学意义;T=10 n M时,24 h组的睾酮促增殖率显著高于48 h组,差异有统计学意义;T=100 n M时,24 h组的睾酮促增殖率显著高于48 h组,比较差异有统计学意义。不同浓度的睾酮作用于A2780细胞24 h后,各组OD值分别为:DMSO（1.98±0.61）、T=1 n M（1.94±0.05）、T=10 n M（1.95±0.04）、T=100 n M（1.92±0.06）,各组之间差异无统计学意义。作用时间延长至48 h,各组OD值DMSO（1.90±0.12）、T=1 n M（1.89±0.13）、T=10 n M（1.86±0.18）、T=100 n M（1.88±0.14）,各组之间差异无统计学意义。3.氟他胺预处理SKOV3细胞1 h后,各组OD值:DMSO组（1.73±0.27）、睾酮组（2.14±0.34）、氟他胺（1.35±0.04）、氟他胺+睾酮（1.43±0.07）,差异有统计学意义。组间比较:睾酮组较DMSO组细胞增殖能力明显升高,有统计学差异;氟他胺联合睾酮组较睾酮组细胞增殖能力明显降低,差异有统计学意义;氟他胺组与DMSO组差异无统计学意义;氟他胺组与氟他胺联合睾酮组差异无统计学意义。4.sh310-AR转染细胞SKOV3后,RT-PCR检测AR-mRNA在sh310-AR/SKOV3细胞中（0.13±0.01）较sh310-NC/SKOV3细胞（0.62±0.07）显著降低,差异有统计学意义（P=0.005）;WB检测AR蛋白在sh310-AR/SKOV3细胞中（0.03±0.02）较sh310-NC/SKOV3细胞（0.22±0.05）也显著降低,差异有统计学意义（P=0.004）;睾酮作用于转染前后的SKOV3细胞24 h,结果表明睾酮对sh310-AR/SKOV3细胞的促增殖作用（1.71±0.09）较sh310-NC/SKOV3细胞（1.87±0.09）显著降低,差异有统计学意义（P=0.043）。5.AB6398-AR转染细胞SKOV3后,RT-PCR检测AR-m RNA在AB6398-AR/SKOV3细胞中（0.77±0.02）较AB6398-NC/SKOV3细胞（0.57±0.01）显著升高,差异有统计学意义（P<0.001）;WB检测AR蛋白在AB6398-AR/SKOV3细胞中（0.60±0.16）较AB6398-NC/SKOV3细胞（0.25±0.12）也显著升高,差异有统计学意义（P=0.040）;睾酮作用于转染前后的SKOV3细胞24 h,结果表明睾酮对AB6398-AR/SKOV3细胞的促增殖作用（2.77±0.12）较AB6398-NC/SKOV3细胞（2.34±0.12）显著升高,差异有统计学意义（P=0.001）。6.AB6398-AR转染细胞A2780后,RT-PCR检测AR-m RNA在AB6398-AR/A2780细胞中（0.77±0.01）较AB6398-NC/A2780细胞（0.46±0.07）显著升高,差异有统计学意义（P=0.002）;WB检测AR蛋白在AB6398-AR/A2780细胞中（0.00±0.00）较AB6398-NC/A2780细胞（0.00±0.00）无明显变化,差异无统计学意义（P=0.317）;睾酮作用于转染前后的A2780细胞24 h,结果表明睾酮对AB6398-AR/A2780细胞的促增殖作用（2.50±0.02）与AB6398-NC/A2780细胞（2.51±0.02）无差别,差异无统计学意义（P=0.134）。小结:1.睾酮可以促进AR阳性的SKOV3细胞增殖,对于AR阴性的A2780细胞无促增殖作用。2.睾酮对SKOV3细胞的促增殖作用可以被AR拮抗剂氟他胺所阻断。3.敲低/过表达SKOV3细胞的AR可以阻断/增强睾酮对SKOV3细胞的促增殖作用。第三部分雄激素/雄激素受体影响上皮性卵巢癌发生发展的相关机制研究目的:初步探求PI3K/AKT信号通路在雄激素/雄激素受体促进上皮性卵巢癌发生发展中的作用。方法:1.免疫组织化学染色法检测上皮性卵巢癌组织及癌旁组织中AKTp-AKT的表达。2.利用Western blot检测SKOV3、A2780细胞内AKT和p-AKT蛋白水平。3.敲低SKOV3细胞中AR对AKT、p-AKT的表达水平的影响。4.过表达SKOV3细胞中AR对AKT、p-AKT的表达水平的影响。5.MTS法检测PI3K/AKT信号通路抑制剂BEZ235对睾酮的促SKOV3细胞增殖作用的影响。结果:1.上皮性卵巢癌组织及癌旁组织中均有较高水平AKT、p-AKT表达,胞核胞浆中均可见。经半定量后统计分析,因评分结果不符合正态分布,因此结果用中位数（四分位间距）描述,非参数秩和检验进行数据分析。AKT表达水平在上皮性卵巢癌组织为6（3.75）,癌旁组织为5（2）,两组相比差异无显著性（P=0.815）,而p-AKT蛋白水平在在上皮性卵巢癌组织为2（5）,癌旁组织为2（1.25）,两组之间比较差异有统计学意义（P=0.034）。两组p-AKT/AKT的比值也存在显著差异,在卵巢癌组织中0.67（0.67）,在癌旁组织中0.33（0.23）,差异有统计学意义（P=0.005）,与AR的表达规律一致。2.SKOV3细胞的AKT（1.16±0.18）和p-AKT（0.66±0.19）蛋白水平均显著高于A2780细胞的AKT（0.39±0.10）和p-AKT（0.10±0.05）蛋白水平,差异有统计学意义（AKT:P=0.003、p-AKT:P=0.009）。同时SKOV3细胞的p-AKT/AKT值（0.56±0.08）亦高于A2780细胞（0.28±0.14）,差异有统计学意义（P=0.041）。3.sh310-AR转染细胞SKOV3细胞后,AKT的表达水平在sh310-AR/SKOV3细胞（1.75±0.08）与sh310-NC/SKOV3细胞（1.74±0.25）中无明显差异（P=0.953）,但p-AKT表达水平在sh310-AR/SKOV3细胞（0.15±0.06）中较sh310-NC/SKOV3细胞（0.50±0.08）显著下降,差异有统计学意义（P=0.001）。4.AB6398-AR转染细胞SKOV3细胞后,AKT的表达水平在AB6398-AR/SKOV3细胞（0.83±0.05）较AB6398-NC/SKOV3（0.86±0.12）无明显差异（P=0.681）,但p-AKT表达水平在AB6398-AR/SKOV3细胞（0.68±0.09）较AB6398-NC/SKOV3（0.33±0.20）显著升高,差异有统计学意义（P=0.002）。5.不同浓度的BEZ235处理SKOV3细胞24 h后,spss软件probit模块计算IC50=187 n M。BEZ235与睾酮联合作用于SKOV3细胞24 h后,各组OD值DMSO组（2.09±0.10）、睾酮组（2.71±0.12）、BEZ235（1.55±0.12）、BEZ235+睾酮（1.50±0.15）,差异有显著性。其中BEZ235+睾酮组SKOV3细胞的增殖能力较单纯睾酮组显著下降（P<0.001）,BEZ235组与BEZ235+睾酮组之间细胞增殖能力无显著差异（P=0.606）。小结:1.在上皮性卵巢癌组织及癌旁组织中,AKT的表达水平无显著差异p-AKT的表达水平在癌组织中显著高于癌旁组织,且p-AKT/AKT比值在上皮性卵巢癌组织中也较高。2.在AR阳性的SKOV3细胞中,AKT、p-AKT的表达水平以及p-AKT/AKT比值均高于AR阴性的A2780细胞。3.敲低/过表达SKOV3细胞的AR,会相应降低/增加AKT的磷酸化水平,而总AKT水平无显著变化。4.PI3K/AKT信号通路抑制剂BEZ235可以阻断睾酮对SKOV3细胞的促增殖作用。