紫花针茅ERF转录因子基因的克隆及功能研究

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AP2/ERF(乙烯响应因子)基因家族是植物特有的转录因子家族。根据他们含有的结构域数目和序列特点将它们分为:AP2、DREB、ERF、RAV和Soloist几个亚家族。AP2/ERF基因家族参与调节许多生物过程,如植物发育、衰老、抗病反应及抗非生物胁迫响应等。ERF亚家族参与植物对乙烯、茉莉酸、ABA等激素的响应及调节,同时也参与植物对生物及非生物胁迫的抗性响应。ERF转录因子通过和防御胁迫相关基因启动子区的GCC元件相结合调控下游基因的表达;一些ERF转录因子也可以通过和干旱响应基因启动子区DREB顺式元件相结合来参与抗旱等非生物胁迫,说明ERF基因在植物抗非生物胁迫中同样具有重要作用。目前对于ERF家族基因功能研究最多的是拟南芥、水稻、小麦、番茄等植物,对具有优良抗逆性能的野生植物资源研究还很少。  紫花针茅(Stipa purpurea)是青藏高原高寒草原的建群种,在青藏高原干旱、低温区域有广泛分布,也是西藏地区的一种重要的牧草。紫花针茅具有一系列适应干旱胁迫的特点,如叶片卷曲成针状、气孔下陷、叶表皮有丰富的蜡质等。本研究从紫花针茅中筛选出了对干旱胁迫响应变化较大的几个ERF基因,并克隆得到了四个ERF基因编码区的全长,对其进行了序列分析和系统发育研究,同过荧光定量PCR检测了其在非生物胁迫下的转录水平变化,并通过转基因拟南芥对SpERF1基因的功能进行了研究,通过转基因植株抗旱性分析、凝胶阻滞试验、下游基因表达量分析等,深入研究了紫花针茅SpERF1基因的功能,取得的研究结果如下:  1.用cDNA末端快速扩增(RACE)技术从紫花针茅中克隆出了SpERF1、SpERF2、SpERF4、SpERFL1a四个基因的cDNA序列,开放阅读框分别为756bp、978bp、690bp和720bp;序列比对发现这几个基因都具有1个ERF结构域,亚细胞定位结果表明,这几个基因都位于细胞核中。荧光定量PCR表明,这几个基因可以被多种胁迫诱导表达。  2.构建了SpERF1的由CaMV35S启动子驱动的植物过表达载体,采用农杆菌介导法转化野生型拟南芥植株。干旱胁迫下转基因植株生长状况明显好于野生型。转基因植株的存活率、叶片相对含水量、脯氨酸含量都明显高于野生型,而电子渗透率明显低于野生型。  3.凝胶阻滞实验表明,SpERF1蛋白可以和P5CS1、HSP101、RD29A等基因启动子区的DRE顺式元件相结合;转基因植株中这些基因的表达量明显高于野生型。  综上所述,SpERF1基因的过表达提高了转基因植株对干旱胁迫的抗性;SpERF1转录因子通过和P5CS1、HSP101、RD29A等基因启动子区的DRE顺式元件相结合,诱导这些基因的表达,提高了脯氨酸含量,降低了细胞膜渗透率,进而提高了转基因植株对干旱胁迫的抗性。
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