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SARS冠状病毒主要蛋白质包括RNA聚合酶蛋白、S蛋白、E蛋白、N蛋白等。其中S蛋白是负责病毒侵染的主要部分,S蛋白的差异可导致病毒宿主的更迭,并可使宿主产生感冒、腹膜炎、肠胃炎等多种疾病。S蛋白同时也是影响冠状病毒侵染宿主程度的主要成分。本文主要研究了SARS冠状病毒S1基因的原核表达,并对表达蛋白进行初步纯化,利用纯化的重组蛋白建立了检测SARS抗体的ELISA方法。另外还构建了S1基因的真核表达载体。为今后核酸疫苗的研制奠定了基础。 首先以含有S1基因的质粒为模板,对S1基因进行PCR扩增,将扩增的基因片段克隆到pGEM T-Easy载体,经双酶切后进行序列测定和同源性分析。在此基础上构建了S1基因的重组表达质粒pGEX-4T1-S1,转化宿主菌BL21(DE3)。表达的S1蛋白经SDS-PAGE分析,在56KD处有一特异表达条带。激光密度扫描结果表明,融合蛋白占细菌总蛋白的34.36%。经Western blot检测,表达的蛋白能够被SARS阳性血清所识别,为SARS病毒感染诊断和SARS抗体检测方法的建立奠定了基础。 将表达的S1蛋白初步纯化后作为抗原,建立了检测SARS病毒抗体的间接ELISA方法。对ELISA的反应条件进行了研究,结果表明蛋白抗原的最适包被浓度为5.0μg/ml,最适包被条件选37℃孵育一小时然后4℃过夜,HRP-山羊抗人IgG的工作浓度为1:400。其特异性较好,患者血清未与正常血清发生交叉反应。建立的间接ELISA为我国进行SARS病毒的诊断和血清学检测提供了一种技术手段,并为SARS检测试剂盒的研制与开发奠定了前期工作基础。 最后以含有S1基因质粒为模板,对S1基因进行PCR扩增,序列分析正确后构建了真核表达质粒pVAX-S1,转染Hela细胞后的免疫荧光检测结果表明重组质粒在体外细胞中得到表达,为SARS DNA疫苗的研究奠定了一定的基础。