【摘 要】
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D-阿拉伯糖醇是一种新型功能性多元糖醇,在发酵木糖醇的过程中是不可代替的中间产物。自然界中存在的D-阿拉伯糖醇甚少,人工合成D-阿拉伯糖醇过程复杂且成本高昂。本课题研究了酵母产D-阿拉伯糖醇的关键基因的作用机制,为探究同类型的酵母菌株在代谢途径中各种多元醇生物合成之间的关系奠定基础。ARD2基因编码D-阿拉伯糖醇脱氢酶,本文旨在研究该基因对高产多元醇的酵母菌中D-阿拉伯糖醇生成量的影响:以野生型德
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D-阿拉伯糖醇是一种新型功能性多元糖醇,在发酵木糖醇的过程中是不可代替的中间产物。自然界中存在的D-阿拉伯糖醇甚少,人工合成D-阿拉伯糖醇过程复杂且成本高昂。本课题研究了酵母产D-阿拉伯糖醇的关键基因的作用机制,为探究同类型的酵母菌株在代谢途径中各种多元醇生物合成之间的关系奠定基础。ARD2基因编码D-阿拉伯糖醇脱氢酶,本文旨在研究该基因对高产多元醇的酵母菌中D-阿拉伯糖醇生成量的影响:以野生型德巴利酵母（Debaryomyces coudertii FBKL2.0130）为研究对象,采用分子生物学手段获得重组菌株W303-ARD并展开相关研究,主要的成果如下:1.从Debaryomyces coudertii中克隆ARD2目的基因片段,利用闪电克隆技术构建了重组质粒Yep-PAK,并将重组质粒导入到酿酒酵母中W303-1A,得到重组菌株W303-ARD并成功表达。2.克隆自Debaryomyces coudertii的阿拉伯糖醇脱氢酶是一个新的D-阿拉伯脱氢酶基因。由837个碱基组成,编码278个氨基酸,重组蛋白分子量为30.1k Da。3.将表达宿主菌和亲本菌株分别进行发酵实验,发酵结束后进行残糖量和酒精度的测定。结果显示:重组菌株W303-ARD的生长性能及发酵性能与亲本菌株接近,说明导入外源质粒对酿酒酵母的基本功能没有影响。4.酶学性质研究结果显示,与亲本菌株相比,W303-ARD的D-阿拉伯糖醇脱氢酶活力从（32.7±0.803）U/m L提高到了（122.4±1.012）U/m L。重组酶Ar DH的最适反应温度为30℃,在以D-核酮糖为底物的还原反应中,Ar DH的最适p H为9.0,氧化反应的最适作用p H为7.0。Ar DH的氧化活性和还原活性均受到Cu2+、Ba2+、Zn2+的显著抑制,其中Ba2+有较明显的抑制作用;Mg2+对Ar DH的氧化还原活性没有明显的影响;Ca2+、Mn2+、Fe3+均能提升Ar DH的酶活力。
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