成肌细胞移植治疗Duchenne型肌营养不良症模型-mdx鼠的实验研究

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目的:(1)探讨小鼠成肌细胞培养、纯化和鉴定方法。(2)观察成肌细胞移植治疗mdx鼠后骨骼肌抗肌萎缩蛋白的表达及成肌细胞与宿主细胞的融合情况。(3)运用免疫荧光技术和SP免疫组化染色法对DMD/BMD、LGMD-2D,2E,2C型肌营养不良症患者的致病基因编码产物抗肌萎缩蛋白、α-,β-,γ-SG蛋白进行检测,为临床肌营养不良症的确诊和分型建立特异性的诊断手段。 方法:(1)采用Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶消化分离C57BL/6鼠的成肌细胞,用Percoll分离液纯化细胞,在含15%胎牛血清的DMEM培养基中进行成肌细胞培养,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,Desmin抗体鉴定成肌细胞。(2)运用经过纯化、体外培养6天左右处在分裂增殖期并且经过FG荧光标记的成肌细胞进行肌肉注射和静脉注射,移植后1月、2月、3月分别取实验鼠的四肢骨骼肌使用免疫组化法检测抗肌萎缩蛋白的表达情况,利用Hoechst33342荧光染液复染宿主细胞核,荧光显微镜下计数同时有FG和Hoechst复染色的嵌合细胞。(3)利用抗肌萎缩蛋白中央棒状区(Dys1)、C-末端(Dys2)、N-末端(Dys3)单克隆抗体,α-,β-,γ-SG多克隆抗体,借助免疫荧光和SP免疫染色技术对肌营养不良患者骨骼肌细胞膜上的致病基因产物表达情况进行检测。 结论:(1)采用Pecoll纯化、国产胎牛血清培养,可以获得高纯度的成肌细胞。(2)成肌细胞的肌肉注射和静脉注射显示,虽然分布范围有限,但是说明这种方法是可行的具有进一步研究和利用价值,成肌细胞移植治疗能够在一定程度上修复mdx鼠萎缩的肌肉组织。(3)临床患者的免疫组化检查显示,抗肌萎缩蛋白检测,可以在临床上用于DMD/BMD患者的诊断,为临床进行成肌细胞移植治疗提供了简单可靠的检测方法。
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