【摘 要】
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背景和目的N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）甲基化是真核细胞中最常见的一种RNA表观遗传修饰,参与多种哺乳动物的RNA转录后调控。m6A的关键酶包含3种独立组分的复合物:甲基转移酶（writers）,去甲基酶（erasers）,m6A阅读蛋白（reader proteins）。m6A修饰可以通过对靶RNA进行甲基化修饰来调控生物学功能,即通过甲基转移酶和去甲基化酶改变R
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背景和目的N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）甲基化是真核细胞中最常见的一种RNA表观遗传修饰,参与多种哺乳动物的RNA转录后调控。m6A的关键酶包含3种独立组分的复合物:甲基转移酶（writers）,去甲基酶（erasers）,m6A阅读蛋白（reader proteins）。m6A修饰可以通过对靶RNA进行甲基化修饰来调控生物学功能,即通过甲基转移酶和去甲基化酶改变RNA的甲基化状态,以及阅读蛋白结合到具有m6A修饰位点的RNA上,调控RNA的稳定性与核转运等生物学进程,进而改变靶基因的表达水平。目前,大量研究已经证实m6A修饰广泛参与肿瘤的发生发展。随着研究的深入,m6A修饰在肿瘤免疫中发挥的重要作用已被揭示。例如,甲基转移酶METTL3是m6A修饰中主要的调控酶之一,发挥催化活性并将m6A添加到RNA上。最新研究发现,METTL3对肿瘤的发生发展、树突状细胞及CD4+T细胞的分化具有重要调控作用。然而,METTL3如何调控CD8+T细胞的分化及功能尚不清楚。CD8+T细胞在肿瘤免疫治疗中发挥抗肿瘤效应,它能够通过T细胞表面受体,特异性识别肿瘤细胞表面表达的主要组织相容性复合物（MHC-抗原肽分子）进而杀伤靶细胞。CD8+T细胞受到抗原刺激后,绝大部分形成效应细胞并在杀伤后发生凋亡,仅一小部分细胞能够形成在体内长期存在的记忆性亚群,当再次受抗原刺激后记忆性T细胞能够快速分化并发挥杀伤作用。然而,研究表明肿瘤患者体内CD8+T细胞功能记忆亚群比例降低或处于耗竭状态,使其不能持续发挥杀伤作用。因此,促进T细胞记忆亚群的分化,维持其在体内的抗肿瘤效应是肿瘤免疫治疗中亟待解决的关键科学问题。在本研究中,我们通过构建条件性敲除METTL3小鼠,探究METTL3对CD8+T细胞分化与抗肿瘤效应的影响,从表观修饰角度阐明调控CD8+T细胞分化及功能的机制,能够为改善肿瘤免疫治疗提供新的策略。方法（1）利用CRISPR/Cas9技术构建Mettl3fl/fl小鼠,与Lck-Cre小鼠杂交获得Mettl3fl/fl LckCe小鼠,即条件性敲除小鼠;（2）采用流式细胞术分析Mettl3fl/flLckCre小鼠与Mettl3fl/fl小鼠脾脏中CD8+T细胞与分化相关的标志物（CD44和CD62L）、表面激活和抑制分子的标志物（CD69和PD-1）以及细胞功能相关的分子（TNF-α、IFN-γ、GranzymeB、IL-2和Perforin）的表达差异;（3）构建小鼠肺癌模型,分析Mettl3fl/fl LckCre小鼠与Mettl3fl/fl小鼠肿瘤生长情况,以及脾脏中CD8+T细胞中分化相关的分子标志物（CD44和CD62L）、表面激活和抑制分子的标志物（CD69和PD-1）以及脾脏和肿瘤组织中细胞功能相关的分子标志物（TNF-α、IFN-γ、Granzyme B、IL-2和Perforin）的表达差异;（4）采用流式细胞术分析肺腺癌患者外周血METTL3高表达和低表达CD8+T 细胞功能分子（TNF-α、IFN-γ、Granzyme B、IL-2、Perforin）分泌的差异;（5）采用测序技术对Mettl3fl/flLckCre小鼠与Mettl3fl/fl小鼠脾脏中CD8+T细胞进行miRNA测序,分析差异基因以及差异基因富集的通路;（6）通过靶基因预测网站,预测miRNA可能作用的靶基因,并采用qPCR、流式细胞术等方法验证其表达;（7）采用双荧光素酶报告实验验证miRNA与靶基因相互作用关系;（8）使用 miRNA 对照（NC）,类似体（mimics）,抑制剂（inhibitor）转染CD8+T细胞,并用流式细胞术检测靶基因的表达和功能分子（TNF-α、IFN-y、Granzyme B、IL-2、Perforin）的表达差异。结果（1）与Mettl3fl/fl小鼠相比,条件性敲除Mettl3fl/fl LckCre小鼠中CD8+T细胞记忆亚群比例、表面激活型标志表达及杀伤功能相关细胞因子的分泌增加,而抑制型标志表达减少;（2）与Mettl3fl/fl小鼠相比,条件性敲除Mettl3fl/fl LckCre小鼠肿瘤体积增长缓慢,肿瘤内CD8+T细胞功能增强。（3）肺癌患者外周血中CD8+T细胞中METTL3低表达促进杀伤功能相关因子的表达;（4）ICOS是mmu-miR-1195的靶基因,METTL3敲除后通过下调mmu-miR-1195,增加ICOS的表达,从而促进T细胞功能。结论CD8+T细胞敲除METTL3可以促进记忆分化、提高其增殖能力和杀伤功能;同时,METTL3通过mmu-miR-1195,降低ICOS的表达从而抑制CD8+T细胞的抗肿瘤效应,为免疫治疗提供了理论依据。
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