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研究背景癫痫是脑部神经元高度同步化异常放电所致,以发作性、短暂性、重复性及刻板性为特征的一组中枢神经系统功能失常的综合征。神经元细胞膜兴奋性增高,易于形成痫性放电,是癫痫发生的病理生理基础。研究发现了越来越多的单基因突变导致癫痫,这些基因大多数编码离子通道或受体,包括电压门控钠、钾、钙、氯离子通道和乙酰胆碱受体及γ-氨基丁酸受体(GABA)。电压门控钠通道主要负责控制细胞兴奋性,其结构和功能异常可引起细胞膜兴奋性改变,在癫痫发病机制中具有重要作用。哺乳动物的电压门控钠通道由α亚基和β亚基组成。α亚基由同一家族的9个基因编码(SCN1A-SCN11A),SCN1A基因编码的蛋白命名为Nav1.1,Nav1.1主要表达在抑制性中间神经元。α亚基是钠通道的功能性单位,由四个高度同源性的结构域(Ⅰ～Ⅳ)通过胞内连接环相连而成,每个结构域含有6个跨膜片段(S1～S6)。4个辅助性β亚基(β1-β4)由基因SCN1B-SCN4B基因编码,在成人中枢神经系统α亚基一般连有β1和β2亚基。SCN1A基因突变主要导致三种癫痫综合症:全面性癫痫伴热性惊厥附加症(generalized epilepsy with febrile seizures plus, GEFS+),婴儿重症肌阵挛癫痫(severe myoclonic epilepsy of infancy, SMEI)和部分性癫痫伴热性惊厥附加症(partial epilepsy with febrile seizures plus, PEFS+)。SCN1B基因的突变主要导致GEFS+。我们在对SMEI患者相关基因筛查中,发现了一个新的SCN1A基因错义突变:c.4868A>C,导致Nav1.1第1623位氨基酸由谷氨酸变为丙氨酸(E1623A),位于Nav1.1第4个结构域S3片断上,而且高度保守。目前,在SMEI患者Nav1.1 S3跨膜片共发现10个突变,但这些突变对钠通道功能的影响还未见报道,Nav1.1E1623A导致癫痫的发病机制值得进一步研究。研究目的通过在HEK 293T细胞异质表达Nav1.1 E1623A和β1和β2亚基,采用全细胞膜片钳记录钠通道的电生理动力学参数,将其与Nav1.1野生型进行比较,探讨SCN1A基因c.4868A>C突变导致癫痫的发病机制。研究方法1. pCMV-SCN1A质粒酶切、测序及Nav1.1表达的鉴定采用内切酶消化pCMV-SCN1A质粒初步鉴定,酶切正确的质粒测序确认SCN1A基因编码区。HEK 293T细胞转染pCMV-SCN1A质粒48h后提取总蛋白,采用蛋白印迹检测Nav1.1的表达。2. pDsred-IRES-SCN1B质粒构建和鉴定采用引入酶切位点的PCR方法从pCMV-Dsred质粒扩增红色荧光蛋白Dsred DNA片段。将Dsred PCR产物克隆到TA载体,测序确认。在pCD8-IRES-SCN1B质粒的基础上内切酶消化去除pCD8标记,回收IRES-SCN1B载体;pDsred-TA质粒内切酶消化回收Dsred DNA片段,采用DNA连接酶连接Dsred DNA片段与IRES-SCN1B载体,即得pDsred-IRES-SCN1B质粒,测序确认SCN1B基因编码区。3. pGFP-IRES-SCN2B质粒酶切、测序采用内切酶消化pGFP-IRES-SCN2B质粒初步鉴定,酶切正确的质粒测序确认SCN2B基因编码区。4. pCMV-SCN1A-E1623A突变体质粒的构建定点诱变试剂盒对pCMV-SCN1A质粒进行定点诱变构建pCMV-SCN1A- E123A质粒,测序确认。5.膜片钳检测HEK 293T细胞共转染pDsred-IRES-SCN1B质粒、pGFP-IRES-SCN2B质粒和pCMV-SCN1A质粒或pCMV-SCN1A-E1623A质粒48h后,在荧光显微镜下可观察到红色荧光和绿色荧光。选择同时表达了红色荧光和绿色荧光的HEK293T细胞进行电生理功能研究。在全细胞电压钳模式下给予标准刺激方案,根据所得钠电流数据建立钠通道的电流密度曲线、电压依赖激活曲线、稳态失活曲线和失活后恢复曲线,计算钠通道的电流密度、半数激活电压、半数失活电压和失活后恢复时间常数等进行比较。6.统计学分析计量资料以均数±标准差( X±S)表示,采用SPSS l6.0软件包进行统计分析,组间比较采用两样本t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。研究结果1. pCMV-SCN1A质粒酶切、测序及Nav1.1表达的检测pCMV-SCN1A质粒测序SCN1A基因编码区未发现突变。Western blot检测结果显示:HEK 293T细胞转染pCMV-SCN1A质粒48h后在蛋白水平得到明显表达。2. pDsred-IRES-SCN1B质粒构建和鉴定成功将红色荧光蛋白Dsred DNA片段连接到IRES-SCN1B载体。pDsred-IRES-SCN1B质粒测序SCN1B基因编码区未发现突变。3. pGFP-IRES-SCN2B质粒酶切、测序测序确认pGFP-IRES-SCN2B质粒SCN2B基因编码区未发现突变。4. pCMV-SCN1A-E1623A突变体质粒的构建测序证实:SCN1A基因第1623位谷氨酸密码子(GAG)突变为丙氨酸密码子(GCG),而该质粒上SCN1A基因其它区段均未出现意外突变。5.膜片钳检测Nav1.1野生型和E1623A突变体在去极化电压为-10mv时,钠通道的电流最大。Nav1.1野生型峰电流密度约为-232.1±19.1pA/pF,激活曲线半数激活电位(V1/2)为-24.8±0.4mv(n=10),斜率因子K为5.2±0.3;稳态失活曲线半数失活电位(V1/2)为-53.0±0.5mv(n=10),斜率因子K为-8.6±0.4;失活后恢复时间常数τfast和τslow分别为1.4±0.1ms(n=9)和39.9±6.0ms。与Nav1.1野生型相比,E1623A突变体峰电流密度约为-100.7±16.2pA/pF,明显降低(p<0.05)。激活曲线半数激活电位(V1/2)为-24.6±0.5mv(n=7),斜率因子K为8.4±0.4(p<0.05),激活速度减慢;稳态失活曲线向超极化方向移动,半数失活电位(V1/2)为-60.9±0.5mv(n=7)(p<0.05),斜率因子K为-11.5±0.5(p<0.05),失活加快;失活后恢复时间常数τfast和τslow分别为2.1±0.2m(sn=6)(p<0.05)和42.5±6.9ms,失活后恢复时间延长。结论1. Nav1.1 E1623A突变体的电流密度降低,激活速度减慢,失活加快,失活后恢复时间延长,Nav1.1 E1623A突变体功能减弱,表现为“partial loss of function”。2. Nav1.1 E1623A突变体可能导致抑制性中间神经元Nav1.1功能减弱,对兴奋性神经元抑制作用降低,从而引起兴奋性神经元兴奋性增高,这可能是该患者癫痫发病的主要机制,可为该患者选择抗癫痫药物提供参考。