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猪轮状病毒(Porcine Rotavirus，PRV)属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属，是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之一。小日龄动物最为易感，人、猪、火鸡、绵羊等多种动物都是轮状病毒的自然宿主。轮状病毒引起的腹泻是一种世界性疾病，给人类健康和畜牧业发展造成严重危害。目前，虽然有PRV疫苗可用于该病的预防，但还未有效控制该病流行，迫切需要研制新型疫苗和探索新的免疫机制来预防和控制PRV感染发病。病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)在病毒形态上与真正病毒相同或相似，具有良好的免疫原性和反应原性，在疫苗研究上有广阔应用前景。国外已经有成功组装PRV VLPs的研究报道，且在疫苗研究、动物免疫试验中都取得了可喜的成果，为本实验提供了切实可行的理论依据。本研究参考GenBank已发表的PRV G5型OSU毒株VP4／6／7全长基因组序列和5株人源PRV VP2全长基因序列，分别设计合成4对引物对我国江苏分离的PRV毒株(简称JS毒株)，采用RT-PCR方法扩增全基因片段，为了对VP2基因进行生物学特性分析，因此又扩增完成了OSU毒株VP2全基因片段。将扩增基因分别克隆到pMD18-T载体，筛选阳性重组质粒序列测定。测序结果显示：JS毒株与OSU毒株VP2全基因序列均为2717bp，编码890个氨基酸，同源性比较发现二者核苷酸同源性为99.9％，氨基酸同源性为99.91％，虽然二者与人wa毒株VP2基因同源性最高，但通过系统发育进化树分析，发现其与猪源HP140毒株的亲缘关系最近；VP4基因全长2342 bp，编码776个氨基酸，15株PRV A群VP4全基因序列进行同源性比较，核苷酸同源性分别在69.2～99.5％，推导氨基酸同源性在70.2～99.1％之间，氨基酸45～250位变异率较高，有突变、插入和缺失现象，其中胰酶作用位点氨基酸241、247位高度保守，系统发育进化树分析，JS毒株与OSU、JL94毒株亲缘关系最近；VP6全基因序列1320bp，编码389个氨基酸，9株PRV VP6全基因同源性比较，核苷酸同源性在77.1％～91.1％之间，氨基酸的同源性在89.7％～99.5％之间，系统发育进化树显示，10株PRV可以分为4个群，JS毒株与B131、OSU、CN86毒株亲缘关系较近，为一个群；VP7基因全长1062bp，编码326个氨基酸，与已知的15个毒株VP7全长基因的核苷酸及推导的氨基酸序列比较，同源性分别为74.5％～78.5％和75.2％～83.1％之间，核苷酸系统发育进化树结果发现，JS毒株与RV G9型参考毒株ICB2185、O-1亲缘关系较近，为一个进化群，表明JS毒株血清型为G9型。根据测序结果重新设计合成另4对引物，上游均含BamHⅠ酶切位点，下游均含SalⅠ酶切位点的，以鉴定阳性重组质粒为模板扩增目的片段后，分别克隆至真核表达载体pFastBac的BamHⅠ、SalⅠ之间的多克隆位点。经酶切、PCR和序列测定鉴定正确后，将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，在其转座酶作用下进行转座，得到Bacmid-VP2／4／6／7重组基因组。纯化后与脂质体共转染sf9细胞，72小时后收获重组病毒，盲传3代后提取重组病毒DNA进行PCR鉴定。SDS-PAGE、Western blot分析，表明PRV JS毒株VP2、VP4蛋白获得表达并具有良好的生物学特性。为了研究PRV VLP的形态学特性，VP2重组病毒单独转染sf9细胞，培养物上清经蔗糖密度梯度离心纯化后，电镜负染观察到直径约40nm左右的核心样颗粒，在形态、直径大小上都接近真实的病毒粒子。