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甘草次酸是一种齐墩果烷型五环三萜化合物,主要来源于植物甘草中,具有保肝、抗病毒、抗过敏和抗癌症等药理生理学活性。目前主要是从植物中提取与化学法相结合的方法获取甘草次酸,整个过程需要消耗大量的酸、碱和淡水,易造成环境污染和生态破坏等严重的问题,还有,多年生的甘草生长周期长、需占用大量耕地,加之甘草采挖严格受政府和法规管控,导致现有资源远远不能满足化工、医药和食品等领域的需求。为了改善其获取方式、提高甘草次酸的产量,本研究采用合成生物学与代谢工程的方法结合转录组学分析,在酿酒酵母中引入植物甘草中甘草次酸的合成途径,经过新基因挖掘、途径优化与调控,实现了酿酒酵母中甘草次酸的高效合成。主要的研究结果如下:(1)在酿酒酵母中引入植物甘草中甘草次酸合成所需的基因:β-香树脂醇合酶基因、β-香树脂醇碳11位氧化酶基因、11-氧-β-香树脂醇碳30位氧化酶基因和CYP450还原酶基因,利用多质粒共表达的方式,成功地在酿酒酵母中合成了甘草次酸,产量为20.4±7.7μg/L。利用GC-MS鉴定了工程菌发酵的代谢产物,确认了多种甘草次酸的前体物:11-羟基-β-香树脂醇、11-氧-β-香树脂醇和30-羟基-11-氧-β-香树脂醇等,除此之外,还有一些副产物的产生,如30-羟基-β-香树脂醇和11,30-羟基-β-香树脂醇。(2)为了得到催化效率高、专一性强的CYP450氧化酶,对整个甘草转录组数据库以及相关植物的基因组数据库进行了深入的分析,利用Nt-Identity、氨基酸相似度、转录组功能注释和催化反应的相似性以及基因簇挖掘等共得到了多个基因编码的酶可以催化以β-香树脂醇或11-氧-β-香树脂醇,生成多种新产物:24-羟基-β-香树脂醇、α-乳香酸和24-羟基-11-氧-β-香树脂醇等。同时也鉴定出多个酶可以催化11-氧-β-香树脂醇的碳30位,如MtCYP72A63、Unigene33312、Unigene27475和Unigene37935等。除此之外,还有一些酶的催化产物具有非常复杂的碎片离子峰,无法确定其结构,如Mt106等。(3)对酿酒酵母中甘草次酸的合成途径进行优化调控,首先通过基因组整合的方式将甘草次酸的合成提高了1.25倍,通过菌株筛选的方式使甘草次酸的产量提高了1.32倍,通过CYP450关键酶的替换使甘草次酸的产量提高了1.26倍,产量达42.3±5.8μg/L;通过过表达MVA途径的限速酶与甾醇合成的转录调控因子,使甘草次酸的前体物β-香树脂醇与分支途径麦角固醇的产量分别提高了2.25与1.37倍;通过增加β-香树脂醇碳11位氧化酶的拷贝数,使甘草次酸的前体物11-氧-β-香树脂醇的产量提高18.2倍,到了108 mg/L;通过不同来源的CPR筛选,以平衡CYP450氧化酶的表达,使甘草次酸的产量达到了517.44±35.53μg/L,同时还发现,CYP450与CPR的比例对于CYP450催化效率具有非常大的影响;最后筛选到Uni25647、CYP72A63和GuCPR1作为最优组合显著提高了甘草次酸的合成,摇瓶产量达到了7.4 mg/L。(4)发酵优化方面,葡萄糖补料使11-氧-β-香树脂醇的产量增长为187 mg/L是目前文献报道最高产量的2494倍;乙醇补料时,11-氧-β-香树脂醇最高产量为80 mg/L,甘草次酸的产量提高到18.9 mg/L,是目前文献报道最高产量的947倍。相比葡萄糖补料,乙醇补料可明显提高三萜化合物的合成能力。