扬子鳃蛭（Ozobranchus jantseanus Oka,1912）是一种寄生于乌龟（Mauremys reevesii）颈部及四肢皱褶区的淡水吸血蛭类,仅我国和日本有该寄生虫的分布报道。2014年日本学者首次报道将扬子鳃蛭直接投入液氮冷冻24h后存活率可达到100%,是目前已知的未经任何预处理即能存活于极低温、体积最大的多细胞动物。但其耐超低温的机制未见任何相关报道。本文对扬子鳃蛭的耐低温能力及耐低温远期存活、抗干燥等特性进行了研究;在此基础上,采用光镜、扫描电镜和组织切片染色的方法,研究了其形态学特征、糖原和脂质的分布以及低温适应性形态变化;为进一步探讨该物种耐超低温的机制,将扬子鳃蛭与同属于吻蛭目（Rhynchobdellida）的寄生虫暹罗盾蛭（Placobdelloides siamensis Oka,1917）进行了转录组学、蛋白组学的比较研究。旨在揭示其耐超低温的形态学和分子生物学的机制。主要研究内容和结果如下:1、扬子鳃蛭耐低温和低湿能力的检测经液氮和-80℃冷冻96h后,观察扬子鳃蛭在600min内虫体的恢复情况。结果显示,冻后早期恢复过程液氮组较-80℃组慢,且有13.33±5.77%原鳃丝活动的个体在10h左右死亡。冻后长期生存试验显示,经96h的液氮和-80℃冷冻后存活的扬子鳃蛭个体中,最长可分别存活至41d和45d,常温组为43d（期间各组均用抗凝鱼血饲喂）,且冻后长期生存过程中仍有产卵现象,说明超低温冷冻对虫体的长期生存和繁殖能力影响较小。长期耐冻复苏试验显示,液氮、-80℃和4℃冷冻30d,复苏24后存活率分别为88.33±2.89%,100±0%,95±5.00%,4℃冷冻存活率略低,可能是虫体仍有活动的原因。反复冻融存活试验显示,扬子鳃蛭可经液氮和-80℃的冻融循环（冻12h,室温12h）次数分别为2和13次。含水率测定显示扬子鳃蛭的含水率为74.92±2.95%。耐脱水试验发现扬子鳃蛭在脱水实验中,失水率在84.78%以下时,复水后生存率仍为100%。2、扬子鳃蛭的形态学观察对扬子鳃蛭的外观形态、解剖后的消化系统和生殖系统进行了详细的描述,并进行了其体表的电镜扫描观察以及冰冻切片的HE、糖原和脂质染色。结果显示与其它报道的近缘物种不同的是,扬子鳃蛭具有3对睾丸,且具有多个卵巢囊分支（branches of ovarian sac）;扬子鳃蛭在遇到乙醇、低温、低湿时会产生适应性体态变化,即通过收缩形成半球状结构,且在低湿干燥过程中可观察到其体表呈现明显的玻璃化改变。电镜扫描发现后吸盘有多个孔洞似海绵状,腹面完全折叠且口部收缩明显,背面见较多粘多糖成分。HE染色发现其表皮和内脏周围的组织间隙内有大量含丰富嗜碱性颗粒的酸细胞（Acid cell）以及胶原纤维。糖原染色显示其体表具有大量分泌的粘多糖成分,体内的酸细胞和胶原纤维也含有大量糖原成分。脂质染色显示仅卵巢组织内的卵母细胞包含能被苏丹Ⅳ着色的脂滴。扬子鳃蛭遇冷时,身体强烈收缩呈半球状体态,可能是通过体表和后吸盘上的孔洞将体内游离水大量排出而产生快速脱水,形成玻璃化,有利于耐冻;此外身体的收缩,以及大量的粘多糖成分可保护细胞免受冻害。3、扬子鳃蛭和暹罗盾蛭的转录组学比较研究为探讨扬子鳃蛭耐冻的分子机制以及为后续蛋白质组学的分析提供注释和参考,本文采集了扬子鳃蛭（O.J.组）低温（液氮和-80℃）和常温处理的混合样本,与寄生于马来巨龟（Orlitia borneensis）的暹罗盾蛭（P.S.组）常温处理转录组进行了比较分析,后者是一种不耐冻害的物种。二代测序结果分别获得了43218976和42700616条Raw reads,经组装分别获得了19781和13601个Unigene。针对2个转录组中前200个高表达的基因进行耐冻相关基因分析,结果显示,O.J.组的应激反应相关基因（BAG domain-containing protein、Stress-associated endoplasmic reticulum protein 2）、通道蛋白（Aquaporin-4）、抗氧化（Superoxide dismutase[Mn/Fe]、Microsomal glutathione S-transferase 3、Peroxiredoxin 1）和热休克蛋白（HSP 90-beta）基因的表达量显著高于P.S.组。而糖代谢相关酶类和细胞骨架相关基因表达水平低于P.S.组。O.J.组总体表现为与低温应激相关的转录组特征。进一步对2个转录组的KEEG进行分析比较,扬子鳃蛭高表达的基因主要有HMCN1、col1a2、col11a2、col2a1、THBS1等,它们都是ECM-receptor interaction通路上的重要基因。扬子鳃蛭可能基于该通路,大量合成细胞外基质,有利于耐冻。4、扬子鳃蛭和暹罗盾蛭的iTRAQ蛋白组学比较将扬子鳃蛭分为液氮处理组（PN2）、-80℃处理组（P80）、常温对照组（Pctrl）进行处理,设置暹罗盾蛭为常温对照组（Pctrl2）。分别取处理后的虫体用dd H2O清洗,滤纸吸干虫体后液氮研磨成粉末,提取蛋白进行iTRAQ蛋白组分析。iTRAQ蛋白组共鉴定蛋白2955个。与Pctrl的种内比较中,PN2和P80组分别上调51和461个蛋白,下调295个和13个蛋白;与Pctrl2的种间比较中,PN2、P80和Pctrl,共分别上调1022、1264和1058个蛋白,下调198、118和178个蛋白;两个处理组PN2和P80比较显示,上调21个蛋白,下调1106个蛋白。种内和种间比较均上调的蛋白有15个。对种内比较的上调蛋白进行GO富集和KEGG富集发现,PN2组GO富集于细胞外基质结构组成,胶原纤维等,KEGG富集于ECM-receptor interaction、Focal adhesion等通路;P80组呈现合成代谢旺盛的状态,GO富集于膜的组成、核糖体的结构成分、核糖体、ATP合成、细胞外基质结构成分、糖类、脂类等的合成等,KEGG富集于核糖体、N-甘氨酸生物合成、过氧化物酶体、ECM-受体相互作用、补体和凝血级联等通路。种内比较和种间比较均上调的蛋白有15个,其中9个为胶原蛋白,有Ⅰ型胶原蛋白3个,Ⅴ型、Ⅵ型、Ⅱ型、Ⅺ型、Ⅻ型和Ⅳ型胶原蛋白各一个。另有血管假性血友病因子（Von willebrand factor）、糖基转移酶家族90（Glycosyl transferase family 90）、2个富含半胱氨酸的分泌蛋白（Cysteine-rich secretory protein）、臂板蛋白-5A（Semaphorin-5A）、胱硫醚β合酶（Cystathionine beta-synthase）。结合转录组数据,对这15个上调蛋白对应的转录组基因的表达水平进行分析发现,表达量较高（TPM>300）的基因相对应的蛋白,分别为3个Ⅰ型胶原蛋白和2个富含半胱氨酸的分泌蛋白,以及Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅺ型胶原蛋白和臂板蛋白（Semaphorin-5A）。在这15个蛋白中查找抗冻蛋白（AFP）发现,其中的6个胶原蛋白为抗冻蛋白,分别为3个Ⅰ型胶原蛋白和Ⅱ、Ⅴ、Ⅺ型胶原蛋白。上述15个蛋白在蛋白组种内比较中均上调,在种间比较中上调更明显。且相对应的基因绝大部分在转录组中高表达。通路分析显示,其中10个蛋白位于ECM-receptor interaction通路,分别为9个胶原蛋白和1个血管假性血友病因子（Von willebrand factor）。剩余5个蛋白中,2个富含半胱氨酸的分泌蛋白（cysteine-rich secretory protein）、糖基转移酶家族90（Glycosyl transferase family 90）、胱硫醚β合酶（Cystathionine beta-synthase）均与蛋白的S-糖基化有关,可能在胶原蛋白的糖基化中起作用。iTRAQ蛋白组学比较分析表明,扬子鳃蛭具有多种上调的糖蛋白和糖基化酶类,其多糖以糖蛋白的形式存在,特别是形态学观察到的酸性细胞和表皮的粘多糖成分。其可能是通过这些糖蛋白以及结合糖的胶原蛋白在低温和低湿过程中产生玻璃化,并起到填充组织,保护细胞膜的作用。本实验进一步验证了先前报道的扬子鳃蛭具有的耐超低温和低湿的能力;形态学观察发现,其遇冷时身体收缩呈半球状,有利于大量排出游离水,形成玻璃化,从而引起低湿休眠。HE和糖原染色发现其体内含糖原成分高,主要为分布在表皮的粘多糖和组织间隙中的大量含粘多糖的酸细胞,以及细胞外基质成分的胶原纤维中。结合转录组和蛋白组数据进一步证明,酸性粘多糖以及糖原结合有抗冻蛋白作用的胶原蛋白成分,特别是Ⅰ型胶原蛋白,在冷冻过程中起玻璃化作用,在改变冰的形态,填充组织,保护细胞膜中发挥重要作用。