论文部分内容阅读
研究目的：1.从转录组学层面探讨腰椎间盘突出症(Lumbar disc herniation, LDH)的分子发病机制。2.从转录组学层面揭示电针(Electro-acupuncture, EA)深刺“腰突五穴”治疗LDH的分子疗效机制。研究方法：1.核糖核酸测序(Ribonucleic Acid Sequencing, RNA-seq)样本临床筛选：①分组与治疗：依据诊断标准、纳入标准和排除标准,临床纳入LDH组患者30例。对其进行6次EA深刺“腰突五穴”治疗：即采用直径0.35mm,长75mmm的无菌毫针直刺患侧大肠俞、关元俞及L4、L5、S1夹脊穴,得气后辅以电针治疗,留针25分钟。根据治疗前后所采集的日本骨科协会评估治疗分数(Japanese Orthopaedic Association Score, JOA)腰椎功能评分计算治疗改善率,筛选出治疗改善率排名前8位,且评级均为“良”及以上的患者进行测序。依据纳入标准和排除标准,纳入与上述LDH组测序患者年龄、性别匹配的8例健康对照组受试者,不做治疗处理。②样本采集：LDH组分别于治疗前及6次治疗后采集外周静脉全血,健康对照组纳入后即采集外周静脉全血。选择LDH组测序患者治疗前后的血样与健康对照组受试者的血样,对每例样本单独提取白细胞总核糖核酸(Total Ribonucleic Acid, Total RNA),记为Group 1(LDH组治疗前)、Group 2(LDH组治疗后)和Group 3(健康对照组)。2. RNA-seq研究：①测序流程：首先对上述样本白细胞total RNA进行制备与鉴定,其次进行mRNA的分离与定量,最后构建mRNA文库并上机运算。根据上机结果,分析整个组的表达情况,得出三组数字基因表达谱(Digital Gene Expression Profiling,DGE)。②测序数据分析：比较三组基因表达情况,筛选出在发病和治疗过程中调节方向相反的显著差异基因；对上述基因进行基因本体(Gene Ontology,GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)以及Ingenuity Pathway Analysis (IPA)分析,从转录组学层面探讨LDH的分子发病机制与EA深刺“腰突五穴”治疗LDH的分子疗效机制。3.定量反转录-聚合酶链式反应(Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR)验证：采用qRT-PCR技术对RNA-seq结果进行验证,保证研究的准确性和可靠性。方法如下：首先对total RNA进行反转录,设计qPCR引物并进行扩增条件测试,其次进行qPCR上机,最后生成数据并进行分析。研究结果：1.测序样本临床筛选结果：筛选出了LDH组基因测序的8名患者,纳入年龄、性别匹配的8名健康受试者；采集了测序受试者外周静脉全血样本,分别提取白细胞totalRNA,标为Group1(LDH组治疗前),Group2(LDH组治疗后)及Group3(健康对照组)。2. RNA-seq研究结果：①差异基因筛选结果：Group 1与Group 3对比,得出120个LDH发病相关的差异基因,Group 1与Group 2比,得出76个差异基因。这两部分差异基因中有17个基因重合,且在发病和治疗过程中的表达方向相反。分析该17个差异基因与LDH分子发病机制和EA深刺“腰突五穴”治疗LDH的分子疗效机制相关。②差异基因分析结果：对发病和疗效机制相关的17个差异基因进行GO、KEGG、IPA分析,结果(1)GO富集结果提示与水分平衡相关。(2)KEGG未富集到相关通路。(3)IPA结果：A.通路富集结果提示与白细胞介素17(Interleukin, IL-17)信号转导通路相关,且通路中位于细胞核位置的核心基因为CCL2。分析该基因表达上调可引发并加重LDH的疼痛症状,并通过该通路引发并加重LDH的免疫炎症反应。B.分子网络结果提示富集到了一个与炎症反应、免疫疾病相关的分子网络,且差异基因CCL2、IFI27与非差异基因TNF、IFNG位于网络的中心,具有互作关系。分析CCL2、IFI27基因表达上调通过该网络可引发和加重LDH的疼痛、腰椎间盘退行性变和免疫炎症反应。EA深刺“腰突五穴”治疗LDH的分子疗效机制与LDH分子发病机制中各基因表达调节的方向正好相反。3. qRT-PCR验证结果：对RNA-seq结果中四个重要基因CCL2、IFI27、IFNG、TNF进行qRT-PCR验证,结果表明IFI27、CCL2表达差异较为明显,IFNG.TNF的表达差异不明显,与RNA-seq结果相同。这证实了研究的准确性与可靠性。研究结论：1.LDH部分分子发病机制：①腰椎间盘细胞水分失衡会导致退行性变,从而引发LDH。②CCL2基因表达上调,可引发并加重LDH的疼痛症状。③CCL2基因表达上调,可影响IL-17信号转导通路,引发和加重LDH的免疫炎症反应。④CCL2、IFI27基因表达上调后,通过与TNF、BFNG基因的互作网络,引发和加重LDH的疼痛、腰椎间盘退行性变与免疫炎症反应。2.EA深刺“腰突五穴”治疗LDH的分子疗效机制：①EA深刺“腰突五穴”可在腰椎间盘细胞水转运的过程中起到积极作用,延缓退行性变。②EA深刺“腰突五穴”通过下调CCL2基因表达,缓解LDH的疼痛症状。③EA深刺“腰突五穴”通过下调CCL2基因表达,来调节IL-17信号转导通路,以减轻LDH的免疫炎症反应。④EA深刺“腰突五穴”可下调CCL2、IFI27基因表达,影响与TNF、IFNG等基因的互作网络,减轻LDH的免疫炎症反应,缓解疼痛,延缓腰椎间盘退行性变。