酯酶来源广泛,其种类、结构和催化反应的种类多种多样,因而被广泛地用于食品加工、医药生产、化妆品和新能源开发等领域,是重要的工业酶之一。由于酯酶的来源不同,所以不同酯酶有不同的酶学性质,对其开展蛋白3D结构的研究有利于结构与酶学性质相互之间关系的解析,并从中获得改善酶性质的方法。本研究从黑曲霉GZUF36野生菌株出发,在其转录组中筛选出一种GDSL家族酯酶,通过基因克隆表达进行重组酯酶的酶学性质、晶体3D结构预测和分子对接及粗酶的固定化表征研究,为进一步的实体晶体结构解析和分子改造提供借鉴和指导。主要研究内容和结果如下:（一）毕赤酵母中高活性表达及酶学性质研究通过转录组基因测序根据NCBI数据库筛选出一个GDSL家族酯酶的基因（NCBI Reference Sequence:XP＿001391968.2）,翻译成氨基酸序列共编码293个氨基酸,通过基因克隆进行毕赤酵母表达并纯化,生物信息学分析其等电点4.62,分子量为32.3 kDa,不存在信号肽,应属于胞内蛋白。将编码成熟肽的基因克隆表达至毕赤酵母中,甲醇诱导表达72 h,从发酵上清中获得了1.06±0.06U/mL。使用硫酸铵沉淀和镍柱相结合的方法从发酵上清中纯化重组酯酶,测定的重组酯酶的酶学性质结果表明其最适温度是35℃,最适pH是8.0,并偏爱对硝基苯酚乙酸酯,对对硝基苯酚乙酸酯的Km值为10.64 m M,Vmax值为2.70m M/min。在pH 8.0下有良好的稳定性;在温度低于35℃下有较高的稳定性;普遍不耐受亲水性有机溶剂,对疏水性有机溶剂有良好的耐受性;大多数金属离子对其有微弱的抑制作用,只有三价铁离子对其有强烈的抑制作用;对部分表面活性剂（吐温-80、吐温-20、曲拉通X-100）有良好的耐受性,但对离子型表面活性剂（SDS、CTAB）没有耐受性,基本可以抑制100%的酶活。（二）粗酶固定化（交联酶聚集体）及酶学性质研究当丙酮与粗酶液体积为4:1,交联剂添加量为60μL,交联时间为1小时,离心转数为6000 rpm时为制备重组酯酶交联酶聚集体的最佳条件。在该条件下,重组酯酶交联酶聚集体相对酶活为115±3%,酶活力可达1.22 U/mL左右。测定其酶学性质结果表明最适温度是40℃,最适pH值是9.0,偏爱对硝基苯酚乙酸酯,对对硝基苯酚乙酸酯的Km值为13.53 m M,Vmax值为2.81 m M/min,重组酯酶CLEAs的底物亲和性和最大反应速度有较游离酶有所增加;在pH 3.0-10.0下有良好的稳定性,酶活保持在100%;在温度低于30℃下有较高的稳定性;对亲水性有机溶剂普遍没有耐受性,但也能保留40%的酶活左右,对疏水性有机溶剂有良好的耐受性,并能实现超酶活;大多数金属离子对其有激活作用,三价铁离子对其有抑制作用,但都能保留90%以上的酶活;对表面活性剂有耐受性,可以保留保留50%以上的酶活。（三）同源建模及分子对接试验使用从头计算的方式对重组酯酶预测建模,模型质量检验结果为:Verify 3D得分97.67%,ERRAT的得分是75.427,Z-scores为-6.95。在拉式图（Ramachandran map）中统计显示有70.5%的氨基酸残基处于最合理的区域,26.7%的氨基酸残基处于允许存在的区域,只有2.8%残基处于不合理的位置。综合以上多个评价结果,同源建模构建的重组酯酶模型具有较高的合理性。总体验证结果表明,该结构适用于进一步的结构分析。分子对接显示重组酯酶与对硝基苯基乙酸酯与重组酯酶的Leu100、Ile96、Asn53、Gly92、Pro54、Asn269形成范德华力,与Gln39、Ser43、His272形成常规氢键牢固的结合在一起,与Ser52形成碳氢键,与Ala94、Thr65形成Pi键相互结合。