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益生菌是一类可以提高宿主鱼类健康水平的微生物,具有促进鱼类生长,提高饵料效率,拮抗病原菌,改善水生动物肠道菌群,增强水生动物天然免疫力以及改善养殖水环境等功能。并且,益生菌作为添加剂混合到养殖动物的饲料中,还可能作为抗生素未来的潜在替代品。不过,目前水产所用益生菌多来源于陆生动物,来源于水生动物的益生菌较少。因此,筛选绿色、安全、高效的水生动物源性的益生菌,不仅有助于实现水生动物健康养殖,而且对水产可持续发展有着深远的影响。1.卵形鲳鲹源黑海弧菌的分离鉴定2016年8月海南省昌江县深水网箱养殖的卵形鲳鲹爆发疾病,为了确定引发此次疾病的病原及寻找可行的方法控制疫情,对发病个体进行细菌性病原的分离鉴定,通过腹腔注射的方式进行回归感染,结果表明从病鱼体内分离到3株优势菌,菌株编号分别为HAINUV01、HAINUV02和HAINUV03,通过回归感染,发现HAINUV01毒性最强,14天半致死浓度为(LD50)1.75×102CFU/g鱼体重。对HAINUV01菌株进行生理生化特性和16SrRNA序列分析,利用四个管家基因(mreB、pyrH、recA和rpoA)采用N-J建树法进行系统发育树的组建,确定HAINUV01菌株为黑海弧菌(Vibrio ponticus)。采用纸片扩散法进行药敏试验,结果显示HAINUV01菌株对氟苯尼考等12种抗生素药物具有高度敏感性,对庆大霉素等5种抗生素药物较为敏感,对万古霉素等19种抗生素药物较强耐药。2.卵形鲳鲹源肠道益生菌的筛选鉴定及益生特性评价本研究为了筛选卵形鲳鲹肠道益生菌,利用2216E琼脂培养基和普通海水琼脂培养基,采用点种法,从卵形鲳鲹肠道中分离到434株菌,通过溶血活性、胞外蛋白酶和胞外淀粉酶活性测定,从其中筛选到10株潜在益生菌,通过人工胃肠液耐受性试验,以及细胞表面疏水活性、自凝集百分率、生物表面被膜形成能力等进行评价,最终选择A97作为后续试验的潜在益生菌,该菌株不溶血、蛋白酶活性为Dh/Dc=3.201、淀粉酶活性为Dh/Dc=1.505、对黑海弧菌、哈维弧菌、溶藻弧菌、无乳链球菌拮抗活性分别为Di/Dc=2.373、3.201、1.643和2.051。体内注射显示对卵形鲳鲹是安全的,无致病性。利用16SrRNA和生理生化对A97菌株进行鉴定,确定该菌株为短小芽孢杆菌。药敏结果显示A97对链霉素等11种抗生素药物具有较强的耐药性,对环丙沙星等6种抗生素药物中度耐药,对氧氟沙星等19种抗生素药物高度敏感。3.短小芽孢杆菌A97对卵形鲳鲹的生长、天然免疫水平以及抗病力的影响为了验证在卵形鲳鲹肠道中筛选获得的A97菌株(Bacillus pumilus,短小芽孢杆菌)的益生作用,将A97菌株以及实验室前期筛选得到巨大芽孢杆菌(Bacillus megaaterium)A20菌株、植物乳杆菌(Lactic plantarum)1036菌株分别与饲料混合,制备成含菌量108 CFU/g的饲料连续投喂卵形鲳鲹56天。研究A97菌株对卵形鲳鲹生长、免疫、疾病抵抗能力和肠道结构的影响。结果显示,A97组增重率,特定生长率以及饵料效率均显著高于对照组(P<0.05),饵料系数显著低于对照组(P<0.05)。血清免疫学指标的结果显示,投喂A97菌株的卵形鲳鲹血清溶菌酶活力、血清总蛋白含量和补体50含量显著高于对照组(P<0.05),血清中的酸性磷酸酶活力、碱性磷酸酶活力、过氧化氢酶活力、超氧化物歧化酶活力和谷胱甘肽含量显著低于对照组(P<0.05),而丙二醛含量和总抗氧化能力与对照组无显著差异(P>0.05)。巨噬细胞呼吸爆发活性结果显示,A97组与对照组之间均无显著差异(P>0.05)。人工回归感染黑海弧菌7天结果表明,A97组的死亡率(50.00±2.53%)显著低于对照组(100%)(P<0.05)。通过qPCR技术对投喂56天的卵形鲳鲹的肠道、脾脏、头肾的TLR8基因和TLR9基因的表达量进行分析。结果表明,在卵形鲳鲹的头肾组织中,A97组TLR9基因表达量得到显著提高(P<0.05),而在卵形鲳鲹的肠道组织中,A97组的TLR8基因表达量均得到显著提高(P<0.05),A97组在其余组织的TTLR8基因和TLR9基因表达量没有显著变化(P>0.05)。综上所述,本研究从卵形鲳鲹肠道中分离的短小芽孢杆菌A97菌株能够促进卵形鲳鲹的生长,增强对黑海弧菌的抵抗能力,可以作为潜在益生菌用于养殖生产。