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目的近年来,癌症已成为威胁居民健康的头号杀手。针对目前抗肿瘤治疗药物无特异性作用的现状,越来越多的研究人员不断探索以寻找安全、无毒、高效、经济的抗肿瘤治疗药物。美洲大蠊精制物CⅡ-3是大理大学云南省昆虫生物医药研发实验室研制的主要成分为肽类的一种物质,已有多项研究证实其具有一定的抗肿瘤生物活性,但目前并未完全了解具体的抗肿瘤作用机制。本实验从细胞水平及动物水平分析CⅡ-3对PD-1及PD-L1表达的影响,并初步探讨CⅡ-3的抗肿瘤作用机制。方法1.PD-1、PD-L1在小鼠体内各脏器组织的表达:采用颈椎脱臼法处死小鼠,无菌条件下摘取小鼠主要器官组织:心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、结肠、胸腺、骨髓、淋巴结、脑,Trizol法提取各器官组织的总RNA,以GAPDH为内参照,以PD-1及PD-L1引物进行RT-PCR,所得终产物进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像系统所得图像分析各器官组织的PD-1及PD-L1表达情况。2.肿瘤细胞MFC和L1210的PD-1及PD-L1的表达:复苏MFC和L1210细胞,待细胞培养到一定数量后,将两种细胞分别转移至于离心管内,洗涤后转移至RNase-Free Eppendorf管内,根据QIAGEN公司提供的RNA提取试剂盒进行操作,提取两种细胞总RNA,以GAPDH为内参照,以PD-1及PD-L1引物进行RT-PCR,所得终产物进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像系统分析MFC和L1210细胞中PD-1、PD-L1表达水平。3.美洲大蠊精制物CⅡ-3对MFC、L1210细胞PD-1及PD-L1表达的影响:复苏MFC和L1210细胞,待细胞培养到一定数量后,取MFC和L1210细胞各自离心后弃去上清重悬细胞,台盼蓝计数。调整细胞浓度至实验要求,各取一定量各自加入六孔板内,分为阴性组和不同浓度的CⅡ-3药物组,且不同浓度的药物组均设三个复孔,加样完毕后细胞放置于37℃恒温培养箱内培养24h。24h后吸取板内各孔细胞分别离心洗涤后加入流式荧光抗体染色孵育,孵育后再洗涤2次,加入细胞稀释液（鞘液）重悬,上流式细胞分析仪分析表达PD-1、PD-L1的MFC和L1210细胞的比例。4.美洲大蠊精制物CⅡ-3对L1210荷瘤小鼠PD-1表达的影响及抗肿瘤机制的检测:复苏L1210细胞,待培养到一定数量后,接种至BALB/c小鼠右侧腋下（体重区间为18-20g,6-8周龄）。建立L1210实体瘤模型后,将小鼠随机分为4组并进行给药处理:正常组、模型组、CⅡ-3组、PD-1抗体组。正常组及模型组给予无菌生理盐水（灌胃,20m L/kg,q.d）、CⅡ-3组给予CⅡ-3（灌胃,200mg/kg,20m L/kg,q.d）、PD-1抗体组给予抗PD-1抗体（腹腔注射,200μg/100μL/只/次,q.3.d）,自模型建立后第二天开始给药,持续10天。给药完成后次日,无菌取小鼠外周血、小鼠脾脏,制成单细胞悬液,用荧光抗体染色,通过流式细胞术分别分析活化T细胞、衰竭性T细胞和调节性T细胞。结果1.RT-PCR结果表明,小鼠体内的心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、结肠、胸腺、骨髓、淋巴结、脑均有PD-1和PD-L1表达,且脾、胸腺、骨髓中PD-1和PD-L1表达程度较其他组织高。2.RT-PCR实验结果表明,MFC和L1210细胞均有PD-1、PD-L1的表达,MFC的PD-1表达程度高于L1210,L1210的PD-L1表达程度高于MFC。3.流式细胞术分析表明,MFC和L1210细胞经过美洲大蠊精制物CⅡ-3处理后,细胞表面分子PD-1、PD-L1表达水平降低,CⅡ-3浓度越高,MFC和L1210细胞表面分子PD-1和PD-L1的表达水平越低。4.流式细胞术分析结果显示,相较于模型组,CⅡ-3组外周血CD3+PD-1+T细胞比例下降,CD4+CD25+T细胞比例降低;流式细胞术分析结果显示,相较于模型组,CⅡ-3组脾脏CD3+CD69+T细胞比例增加,CD3+PD-1+T细胞比例下降,CD4+CD25+T细胞比例降低。结论1.免疫检查点分子PD-1、PD-L1在正常小鼠体内大多数器官组织内及肿瘤细胞L1210和MFC上都有一定程度的表达,脾、胸腺、骨髓中PD-1和PD-L1表达程度较其他组织高,L1210的PD-L1表达程度比MFC高。2.美洲大蠊精制物CⅡ-3能够下调MFC、L1210细胞表面分子PD-1和PD-L1的表达。3.美洲大蠊精制物CⅡ-3能够抑制L1210细胞荷瘤小鼠外周血和脾脏T细胞表面PD-1分子的表达,抑制T细胞的耗竭,增强T细胞的活化,降低调节性T细胞的比例。4.初步研究表明,美洲大蠊精制物CⅡ-3的作用可能是通过抑制T细胞PD-1分子的表达,下调PD-1+T淋巴细胞的比例,抑制T细胞的衰竭,降低调节性T细胞比例,增强T细胞的活化来增强免疫应答,发挥抗肿瘤作用。