研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’S disease, AD)是以进行性加重的记忆认知功能减退为主要临床特点的中枢神经系统退行性疾病。AD是引起痴呆的最常见原因,是老年人的常见病、多发病,最早是在1907年由德国医师Alosis Alzeimer’s报道。AD通常起病隐匿,为特点性、进行性病程,无缓解,由发病至死亡平行病程约8—10年,但也有些患者病程可持续15年或以上。AD主要病理学特征是在大脑皮层和海马区域β—淀粉样蛋白(beta-amyloid protein, Aβ)沉淀形成的老年斑(senile plaque, SP)和tau蛋白异常磷酸化形成的神经元纤维缠结(neur-ofillary tangles, NFT)以及出现弥漫性脑萎缩,表现为认知功能的进行性减退,伴有人格和情感控制等方面的异常以及日常生活能力的下降。有统计显示：在美国65岁以上有1/10、85岁以上有近35%的人患AD,这样计算下来美国有超过450万AD患者,预计这一数据在2030年将达到900万人,2050年将达到2500万人,目前,全世界有2500万人有轻微的记忆障碍,很显然几年之后就会被诊断为AD。世界卫生组织估计全球85岁以上人群中约有30%患有AD。在发达国家,AD已成为继心脏病、癌症、中风之后的第四大疾病。AD的社会影响是极大的,仅在美国,每年用于AD的费用将近1100亿美元。我国是一个人口大国,人口老龄化的速度会更快,现在我国60岁以上人口已经超过10%,因而患痴呆的人数将有显著增加,特别是在较高龄人口中该病的患病率会成倍增长。国内有学者对中国东北、西北、东南、西南4个地区3960万人群进行分层、多级、整群抽样研究,经加权调整抽样误差后的结果显示,55岁以上人群AD患病粗略合计为2.0%,65岁以上为3.5%。日趋增多的AD患者将会给患者家庭及社会带来极大危害。近来研究发现,除年龄、遗传和环境因素外,性激素,尤其是雌激素也在AD的发病中有重要的作用。流行病学研究显示,AD的发病有明显的性别差异,女性和男性患者之比为2：1—3：1。除了女性平均寿命较长的原因外,绝经后妇女体内雌激素水平的迅速下降增加了其对AD的易感性,提示雌激素不足与AD之间存在某种联系,雌激素缺乏可能是AD的危险因素。因此,女性绝经后老年痴呆已成为AD的重要类型。雌激素替代治疗(ERT)能延缓女性AD患者的发病年龄。然而,我们也不得不认识到ERT所带来的弊端。应用ERT的妇女,不论是否已做子宫切除术,卵巢癌、乳腺癌等发病危险均有所增加,而且发病危险与ERT使用时间成正比。这是目前制约ERT在临床上应用的一个主要原因。因此,具有雌激素样作用的中药单药或者复方的研究受到了越来越多的关注。中医理论认为“心主藏神”、“肾主骨髓”、“脑为元神之府”,心之气血不足,肾之精气亏损,脑之髓海失充为导致记忆障碍的关键。人参性禀中和,功善滋补强壮,是传统大补元气,调神益智的常用中药。人参皂苷Rgl是已发现的40多种人参皂苷中研究较多的一种人参单体,其主要的靶器官是中枢神经系统。现代药理学研究表明人参皂甙Rgt是人参作用于神经系统和促智的主要有效成分之一,具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力和增强记忆力等作用。本研究选用Aβ25-35作用于原代培养的大鼠海马神经元作为AD的细胞模型,通过流式细胞仪检测人参皂甙Rgl的抗神经元凋亡作用,并且应用荧光实时定量PCR (realtime PCR)及Western Blot检测凋亡相关因子以及雌激素受体的表达以探讨人参皂甙Rgl神经保护作用的机制,从而为临床相关疾病的治疗提供科学依据。目的本实验研究选用Aβ25-34作用于原代培养的大鼠海马神经元作为AD的细胞模型,探讨人参皂甙Rgl的类雌激素样神经保护作用机制,为临床相关疾病的治疗提供科学依据。方法本研究共分为以下两个部分：第一部分原代神经元的培养及阿尔茨海默病细胞模型的制备取新生24小时内的Wistar大鼠,剥离脑膜、分离出海马,加入0.125%胰蛋白酶溶液消化,用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化,反复吹打制成单细胞悬液,于37℃孵箱中孵育,定时在倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长情况。将经过多聚赖氨酸包被的玻片铺于24孔板中,将细胞接种在玻片上,体外原代培养7天后,采用免疫细胞化学染色方法,检测神经元特异性标记物——Microtubule-associated protein-2 (MAP-2)的表达。将Aβ25-35用理盐水溶解,然后用DMEM/F12培养液稀释,过滤灭菌,分装在EP管中置于-20℃冰箱保存,用前在37℃孵箱中孵育7天。海马神经元培养7天后,加入老化处理好的Aβ25-35使Aβ25-35的终浓度分别为0μmol/l、2.5μmol/l、5μmol/l、7.5μmol/l、10μmol/l,分别作用24h、48h、72h,用MTT法及LDH检测细胞活力,从而确定合适的Aβ25－35作用浓度及作用时间。第二部分人参皂甙Rgl缓解Aβ25-35引起的细胞毒性作用及机理研究MTT法及LDH的测定来检测人参皂甙Rgl缓解Aβ25-34的细胞胞毒性作用；AnnexinV/PI双染法检测人参皂甙Rgl对抗Aβ25-35所导致的细胞凋亡；实时定量RT—PCR法检测Bcl-2、Bax、caspase3、ERα、ERβmRNA的表达,免疫印记法(Western blot)检测Bcl-2、Bax、active caspase3、ERα、ERβ蛋白的表达。结果第一部分原代神经元的培养及阿尔茨海默病细胞模型的制备1.Aβ25-35损伤模型的制备Aβ25-35的神经元毒性呈剂量和时间依赖性。各浓度Aβ25-35作用时间为24h和48h时,均未对神经元产生明显的细胞毒性,而在作用时间为72h时的细胞毒性明显增强。MTT和LDH结果均显示,相比其他作用浓度Aβ25－35在浓度为5μmol/l时对神经元的细胞毒性作用最大并且之后达到一个平台期。因此,我们最终选择5μmol/l的Aβ25-35作用来进行进一步的实验。2.神经元形态学改变神经元在培养到大约第7天时,胞体形态饱满,呈锥形或梭形,折光性强,有明显立体感,核仁清晰可见,突起增多、增粗、变长,并出现末端分枝,连成神经网络。Model组与Control组相比较,细胞数目有所减少,折光性减弱,部分细胞变圆,细胞核呈固缩状态,胞体肿胀,失去原有形态,神经元突起减少、变短甚或消失。人参皂甙Rgl组和E2组与Model组相比较,细胞损伤相对较小,细胞形态基本完好。第二部分人参皂甙Rgl缓解Aβ25-35引起的细胞毒性作用及机理研究1.人参皂甙Rgl缓解Aβ25－35的细胞毒性作用MTT和LDH结果均显示,Model组的细胞活力明显低于Control组(P<0.01)；相比Model组,人参皂甙Rgl各组和E2组的细胞活力均有提高,均有显著性意义(P<0.01或P<0.05)；E2组的细胞活力高于Rgl 10-8M组、Rgl 10-7M组和Rgl 10-6M组,但无统计学意义(P>0.05)。2.人参皂甙Rgl对抗Aβ25-35所导致的细胞凋亡荧光显微镜下观察发现,早期凋亡的细胞表现为细胞膜绿色荧光染色而细胞核无染色；晚期凋亡的细胞表现为AnnexinV和PI双染,即胞膜绿染、核红染。Control组各个时期凋亡细胞均极少；Model组较多细胞膜绿染,也有少数细胞核红染；而加入雌激素和人参皂甙Rgl后,早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞数目均明显减少。流式细胞仪分析结果示：Model组早期凋亡细胞的数量明显多于Control组(P<0.01)；人参皂甙Rgl各组和E2组早期凋亡细胞的数量与Model组比较均有所减少(P<0.05)；E2组与Rgl l0-7M组和Rgl 10-6M组早期凋亡细胞的数量大致相当,无显著性差异(P>0.05),但是均比Rgl 10-8M组有明显降低(P<0.05)。3.实时定量RT—PCR法检测Bcl-2、Bax、caspase3、ERα、ERβmRNA的表达(1)Bcl-2 mRNA表达比较Model组Bcl-2 mRNA的表达较Control组有所增高(P＜0.01),人参皂甙Rgl各组和E2组Bcl-2 mRNA的表达均比Model组有所提高(P＜0.01或0.05)；(2)Bax mRNA表达比较Model组Bax mRNA的表达比Control组明显增高(P＜0.01),人参皂甙Rgl各组和E2组mRNA的表达水平较Control组均有显著降低(P＜0.01或P＜0.05); (3)Bcl-2/Bax mRNA表达比较与Control组比较,Model组Bcl-2/Bax的比值明显降低(P＜0.01),人参皂甙Rgl各组和E2组Bcl-2/Bax的比值较Model组显著提高(P＜0.01或P<0＜0.05);(4)caspase3 mRNA表达比较与Control组比较,Model组caspase3 mRNA的表达显著升高(P＜0.01),人参皂甙Rgl 10-7M组、人参皂甙Rgl 10-组和E2组caspase3 mRNA的表达较Model组均有明显降低(P＜0.01),但是人参皂甙Rgl 10-8M组caspase3 mRNA的表达与Model组比较没有统计学意义(P＞>0.05)；(5) ERa mRNA表达比较Control组有ERa mRNA的表达,Model组比Control组ERa mRNA表达显著降低(P＜0.05),人参皂甙Rgl各组和E2组ERa mRNA表达水平相比Model组则有所提高,但是没有显著性差异(P＞0.05)；(6)ERβmRNA表达比较Control组有ERβmRNA的表达,与Control组比较,Model组ERβmRNA表达水平显著降低(P＜0.01),人参皂甙Rgl各组和E2组ER P mRNA表达水平较Model组有显著提高(P＜0.01或P＜0.05)4.免疫印记法(Western blot)检测Bcl-2、Bax、active caspase3、ERα、ERβ蛋白的表达水平(1)Bcl-2蛋白表达比较Model组Bcl-2蛋白的表达较Control组增高(P＜0.05),人参皂甙Rgl各组和E2组Bcl-2蛋白的表达均比Model组有所提高(P＜0.01或(P＜0.05),在人参皂甙Rgl各组和E2组中Rgl 10-7M组Bcl-2蛋白的表达最高,但无显著性差异(P＞0.05)；(2)Bax蛋白表达比较与Control组比较,Model组Bax蛋白表达水平明显增高(P＜0.01),人参皂甙Rgl各组和E2组Bax蛋白表达水平较Control组均有显著降低(P＜0.05)；(3)Bcl-2/Bax表达比较与Control组比较,Model组Bcl-2/Bax的值明显降低(P＜0.01),人参皂甙Rgl各组和E2组Bcl-2/Bax的值较Model组显著提高(P＜0.01),其中E2组Bcl-2/Bax的比值提高最多,但是没有统计学意义(P>0.05); (4) active caspase3蛋白表达比较Model组active caspase3蛋白表达水平高于Control组(P＜0.01),与Model组比较,人参皂甙Rgl各组和E2组active caspase3蛋白表达水平均有降低(P＜0.01或P＜0.05)。(5)ERα蛋白表达比较Control组有ERα蛋白表达,Model组ERα蛋白表达较Control组明显降低(P＜0.01),与Model组相比,人参皂甙Rgl各组和E2组ERa蛋白表达均有所提高,但是没有显著性差异(P＞0.05)；(6)ERβ蛋白表达比较Control组有ERβ蛋白表达,Model组比Control组ERβ蛋白表达显著降低(P＜0.01),加入人参皂甙Rgl和E2后ERβ蛋白表达水平均有显著提高(P＜0.05或P＜0.01)。结论1.人参皂甙Rgl与雌激素都能够缓解Aβ25-35的神经元毒性作用。人参皂甙Rgl的神经保护作用可能与其能对抗Aβ25-34所导致的神经元凋亡密切相关。2.人参皂甙Rgl与雌激素均可以增加抗凋亡因子Bcl-2 mRNA及蛋白水平的表达、降低促凋亡因子Bax mRNA及蛋白水平的表达,从而上调了Bcl-2/Bax的比值,并最终引起了caspase3 mRNA和active caspase3蛋白水平表达的降低,这可能是人参皂甙Rgl的抗神经元凋亡作用机理之一3.体外培养的原代海马神经元中ERα、ERβ共表达,ERβ的表达是ERa表达的2-3倍。4.雌激素受体表达减少在AD发病中起重要作用。人参皂甙Rgl的神经保护作用原因之一是因为其具有类雌激素样作用,并且这种作用主要是通过ERβ来实现的而不是ERα。