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本文针对感兴趣的基因的siRNA靶点的设计，siRNA有效的导入及使RNAi效应纳入人为的控制是目前RNAi技术运用于哺乳动物系统的主要障碍。解决这些障碍，使RNAi技术成熟运用于研究哺乳动物基因功能的研究，具有重要意义。本研究主要进行了如下工作：通过定点诱变的方法改造pAdeasy，消除其原有的AscI、Bsu36I，构建了便于高通量的克隆的腺病毒载体pAd-Ace，pAd-Best.以这两个载体为基础，将Sv40启动子指导下的I-SceI基因的表达盒式结构克隆于pmAdeasy，并用PCR的方法引入I-SceI酶切位点，构建了能够在细胞内自营救的腺病毒载体pmAdeasy-I-SceI。并在HEK293A细胞中得到了验证。构建了U6启动子和U6-tMet杂合启动子指导针对egfp的shRNA的载体pU6-egfp-RNAi，pU6-Met-egfp-RNAi。以其做模板，将PCR扩增出的U6指导下的shRNA表达盒式结构及杂合启动子指导的shRNA表达盒式结构克隆到pAd-Ace上，构建了腺病毒针对egfp的RNAi载体pAd-U6-RNAi和pAd-U6-tMet-RNAi。通过激光共聚焦扫描显微镜检测egfp蛋白发光的强弱，比较了两种启动子指导下的RNAi的效应。以ARIAD公司惠赠的pC4N2-R,S3H/ZF3和pZ12I-PL-2质粒为模板，PCR扩增出转录调控单元，克隆到pshuttle上，并将PCR扩增出的U6指导下的shRNA表达盒式结构及杂合启动子指导的shRNA表达盒式结构也克隆到同一载体上，与pmAdeasy在大肠杆菌BJ5183中进行重组，构建了腺病毒可调控egfp表达的RNAi载体pAd-R-U6-RNAi和pAd-R-U6-tMet-RNAi。通过激光共聚焦扫描显微镜检测egfp蛋白发光的强弱，比较了两种启动子指导下的RNAi效应。