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环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)是一种快速、灵敏度高、特异性强的等温核酸扩增技术,已被广泛用于各领域。同时,LAMP的高灵敏度也使扩增产物开盖检测极易出现污染,而利用闭管检测技术能有效降低污染机率。目前,LAMP结果检测方法主要有电泳、浊度分析、荧光染料、LFD、微流控等,其中应用较多的是电泳、浊度分析、HNB以及SYBR Green I指示剂。现有方法存在需开盖、材料昂贵、颜色变化均属同一色系等不足,为此本实验进行了三项独立的研究,主要研究成果如下:(1)LAMP-ACBK检测系统:本实验引入一种新型的金属指示剂-酸性络蓝K(Acid Chrome Blue K,ACBK)建立了闭管LAMP结果可视化检测技术。首先,我们在LAMP扩增的起始体系中,分别测试了ACBK与缓冲液、dNTPs、引物、Mg2+等组分的反应,确定了含ACBK的LAMP体系其颜色变化由Mg2+决定,化学方法也进一步验证了这一结论。随后以花椰菜花叶病毒35S启动子(CAMV35S,35S)为靶基因,建立了35S LAMP-ACBK检测体系。该体系的检测灵敏度针对转基因水稻的检测限为100拷贝,在分别含有50 ng的水稻、大豆、油菜和玉米基因组中能检测出0.1%的转基因含量。同时,利用不同转化事件及不同转基因作物为材料验证了其检测特异性,结果表明构建的35S LAMP-ACBK检测系统具有很强的检测特异性。最终,将该检测体系成功用于对实际玉米样品转基因成分的检测,检测结果既可以裸眼直接判断也可以借助紫外可见光谱分析。(2)LAMP-G-四联体过氧化物酶检测系统:以G-四联体过氧化物酶实验所产生的绿色为基础建立了LAMP扩增和结果可视化检测技术。首先,在LAMP扩增体系中分别加入(FIP/BIP,FLP/BLP),(FIP/BIP-G4,FLP/BLP),(FIP/BIP,FLP/BLP-G4),(FIP/BIP-G4,FLP/BLP-G4)四组引物组合,在63°C(12,24,36,48,60)min,85°C 2 min扩增条件下扩增,确定了(FIP/BIP,FLP/BLP-G4)为LAMP扩增引物。随后以含35S的转基因材料模板,建立了35S LAMP-G-四联体过氧化物酶检测系统,且该系统针对转基因水稻的检测限为32 ng/μL。同时,利用不同转化事件及不同作物的转基因材料验证了其检测特异性,结果表明构建的35S LAMP-G-四联体过氧化物酶检测系统具有很强的检测特异性。(3)LAMP-试纸条检测系统:本研究旨在建立一种基于试纸条的35S或TNOS的LAMP扩增结果检测方法,该方法在LAMP扩增结束后2-3 min内即可用肉眼判读结果。首先对修饰后的LAMP引物做了可用性检测,随后,对试纸条的特异性及灵敏度进行了评价。结果显示,评价所用的5种阳性样品均出现质控线与检测线,电泳呈特异的梯状条带,与普通PCR结果一致。表明该试纸条可用于35S及TNOS LAMP扩增结果的检测,且有较高的特异性,两种试纸条的灵敏度分别为5.4 ng/μL、27.2 ng/μL。